大菱鲆疾病早期快速檢測方法——膠體金免疫層析試紙的研制與建立

王蔚芳，柴書軍，劉慶堂，雷霽霖，丁福紅，洪 磊，劉新富，蘇 柯

(1．中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室，青島 266071;2．河南省農業科學院，河南省動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002;3．青島通用水產養殖有限公司，青島 266404)

1 前言

魚類是具有細胞免疫和體液免疫系統的水生脊椎動物，抗體(免疫球蛋白)是機體免疫應答反應的最主要介質。當魚體受到外來物質刺激后(如病害、疫苗等)，其體內會產生相應的抗體以保護機體免受病害的侵襲［1］。據此，通過對特異性抗體的檢測，便可實現對疾病的早期診斷和預警，并能對疫苗免疫效果進行評價。然而，現有的抗體檢測方法如酶聯免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫熒光、核酸雜交技術等，均存在檢測費時費力、成本高且需要專用儀器或專業人員操作等問題，不利于抗體的現場快速檢測，限制了魚病的早期快速診斷。因此，在當前水產養殖高度發達時期，研究建立一種適用于魚類抗體的快速、靈敏、經濟適用、操作簡便的現場快速檢測方法就顯得特別迫切。

通過膠體金免疫層析原理研制成功的檢測試紙可以做到不需要專業技能和儀器，操作簡單，易于推廣應用，是實現養殖魚類抗體現場快速檢測和病害早期快速診斷的一種有效方法。自20世紀80年代末以來，這一方法已應用于多種分析物，包括抗原、半抗原、抗體和核酸的定性和半定量快速檢測［2］，已成為當代最快捷、敏感的免疫學檢測技術之一，并廣泛應用于醫學領域［3］，然而在水產養殖領域，該研究與檢測方法的建立尚屬首次。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是從歐洲引進我國的海水養殖名貴魚種，現已成為我國北方工廠化養殖的主養品種之一。隨著養殖規模的迅速擴大和養殖密度的不斷增加，疾病問題日顯突出［4］。為了推進大菱鲆工廠化養殖的健康持續發展，研究病害的早期快速診斷和及時有效的防治技術顯得極為重要。分析膠體金免疫層析檢測試紙在陸生動物、畜牧業上的成功應用，引發人們考慮將其引入海水養殖魚類中應用的可行性。文章采用膠體金免疫層析原理，結合水生動物的免疫學與生態環境特點進行結構與方法上的整體改造，以成分單一的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為模擬病原，制作大菱鲆抗體檢測試紙，用以檢測其BSA抗體，建立起首個大菱鲆抗體快速檢測技術。一方面可以驗證膠體金免疫層析檢測試紙在海水魚類中應用的可行性，另一方面有利于建立大菱鲆抗體檢測試紙的通用模型并使之迅速達到實用化。在此基礎上，如更換試紙上的BSA印記，便可以制備成其他疾病的抗體檢測試紙，進而可供研發水產動物系列病害和藥物殘留等多種用途的新型快速檢測工具。這一方法的成功建立在水產養殖領域中無疑具有重要的理論意義和廣闊的應用前景。

2 材料與方法

2．1 實驗動物

實驗用健康大菱鲆系購自青島通用水產養殖有限公司，平均體重為700～800 g;用于制備多克隆抗體的新西蘭白兔系購自河南省農業科學院，體重約2 kg，飼養于實驗室動物房內備用。

2．2 大菱鲆血清免疫球蛋白的提取與純化

從健康大菱鲆尾靜脈采血，室溫下靜置1 h，4 ℃過夜，次日離心(5000 r/min，30 min，4 ℃)分離血清，分裝并保存于-70℃冰箱待用。

大菱鲆血清免疫球蛋白(immunoglobulin M，IgM)分離純化的操作方法如下:大菱鲆血清以等體積0．01 mol/L(pH=7．4)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)稀釋后，在 0．01 mol/L(pH=5．4)磷酸緩沖液(phosphate buffer，PB)中4 ℃透析，離心(3000 r/min，30 min，4℃)收集沉淀后，將沉淀溶解于0．1 mol/L(pH=5．4)PB中后繼續按上述方法透析，再次離心收集沉淀后將其溶解于0．1 mol/L(pH=8．6)PB中，通過 Sephadex-200凝膠柱(80 cm × 1．5 cm)的進一步純化，以0．1 mol/L(pH=8．6)PB為洗脫緩沖液，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢驗，收集純度高的樣品，-70℃保存備用。

2．3 多克隆抗體的制備及檢測

將純化的大菱鲆血清IgM與等體積的弗氏完全佐劑(Pierce，USA)混勻乳化后，對新西蘭白兔背部皮下多點注射，每兔注射1 mL(含0．1 mg IgM)(首免);21 d后，將 IgM與弗氏不完全佐劑(Pierce，USA)等比混勻乳化后，進行加強免疫，每兔注射1 mL(含0．2 mg IgM)(二免);21 d后，以相同劑量和方法再次加強免疫(三免);21 d后，以2 mL(含0．3 mg IgM)的量再次加強免疫(四免)。四免21 d后通過心臟取血并分離血清，保存于-70℃冰箱備用。免疫期間定期從兔耳緣靜脈取血，分離抗血清，用間接ELISA法檢測兔血清抗體效價。

2．4 間接ELISA法的建立及抗體的檢測

兔抗IgM血清效價檢測:以0．05 mol/L(pH=9．6)碳酸鹽溶液稀釋 IgM 至 2 μg/mL，取 50 μL 稀釋液加入96孔酶標板孔中，置4℃冰箱中過夜包被，次日以0．01 mol/L(pH=7．4)磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline with 0．05%Tween-20，PBST)洗滌3次，每次3 min;用5%豬血清于37℃封閉1 h，封閉結束后以PBST同法洗滌;將兔抗IgM血清作為第一抗體，以1︰100開始倍比稀釋，每孔加入50 μL，陰性對照為PBS，于37℃反應15 min后以PBST同法洗滌;每孔加入50 μL羊抗兔IgG-HRP(1︰1000稀釋)，于37℃反應30 min后洗滌;每孔加入新配制的50 μL顯色液四甲基聯苯胺 (3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB)顯色5 min后，加入2 mol/L硫酸溶液50 μL終止反應;結果判定用自動酶標儀讀取OD450值(P/N≥2．1時判定為陽性)。此處的OD450為450 nm波長時的光密度值;P為酶標板各孔的讀值;N為酶標板陰性對照孔的讀值。

本實驗室已制備保存的大菱鲆BSA免疫血清效價檢測:BSA包被、封閉方法同上，將BSA免疫血清作為第一抗體;本實驗制備的兔抗IgM血清(1︰10000)作為第二抗體，其他反應同上。

2．5 檢測試紙制備

2．5．1 材料準備

實驗用主要材料為玻璃纖維素膜、AE99硝酸纖維素膜(NC膜)、支持板(購自德國S＆S公司)，氯金酸(由上海化學試劑公司提供)、葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，SPA)(由北京本元正陽基因生物有限公司提供)。另外，X-only單向噴點儀、CM4000切割機、BioDot-TSR 3000讀條儀由美國BioDot公司提供。

2．5．2 多抗的純化

采用辛酸-硫酸銨鹽析法［5］純化由2．3獲得的多抗，即兔IgG。透析后測定其效價水平及蛋白質含量，分裝并于-20℃凍存備用。

2．5．3 金標抗體及金標抗體玻璃纖維素膜的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金［5］，制備的膠體金顆粒直徑為20 nm。多抗的膠體金標記按照文獻［5］進行，其中膠體金溶液的 pH值為8．5，多抗的標記濃度為0．3 mg IgG每毫升膠體金。

玻璃纖維素膜用正常兔血清完全浸潤以降低其非特異吸附性，43℃干燥3 h后，在干燥器內室溫保存備用。將膠體金標記的多抗溶液用X-only單向噴點儀均勻噴灑于已處理過的玻璃纖維素膜(20 mm ×4 mm)上，43℃干燥3 h后，加入干燥劑密封保存于干燥的室溫環境。

2．5．4 印膜制備

將NC膜置于噴點儀平臺上，BSA(4 mg/mL)放入貯存池A，SPA(0．8 mg/mL)放入貯存池B。展平NC膜，并放上壓條，開機后將BSA和SPA分別點射于NC膜上形成檢測線和對照線。兩線相距0．5 cm，位于NC膜的中間，距離膜的邊距均為0．75 cm。在室溫下自然干燥后，置于密閉室溫保存備用。

2．5．5 試紙的組裝

將NC印膜、金標抗體玻璃纖維素膜(結合墊)、玻璃纖維素膜(樣品墊)及吸水紙(吸水墊)按照從下到上的順序組裝在不干膠支持板上(見圖1)。將組裝的半成品試紙放入CM4000切割機槽內，進行切割，以塑料外殼包裝后制備成品試紙，注明生產日期，放入干燥劑一起密封，置于室溫下保存備用。

圖1 檢測試紙各部分組裝結構示意圖Fig．1 Schematic diagram of the test strip showing its several components

2．5．6 試紙工作原理及程序

應用試紙進行檢測時，將待檢樣品滴入樣品墊區，在毛細作用下，滴入的樣品會沿著試紙一直遷移擴散到吸水墊處。當檢測樣品呈陽性時(含抗BSA的IgM，即BSA-IgM)，樣品中待檢測的BSA-IgM會與結合墊上的金標抗體(兔抗IgM)結合形成膠體金抗體復合物，此復合物會與NC印膜上檢測線處的BSA結合，并在檢測線區形成肉眼可見的膠體金紅色條帶。如果檢測線不顯紅色，則說明檢測樣品為陰性。無論檢測樣品是陽性還是陰性，金標抗體都會與NC印膜上對照線處的SPA結合并顯紅色條帶。

2．5．7 試紙性能測定

1)試紙檢測特異性分析。將已制備的大菱鲆抗BSA抗血清(BSA免疫后1～10周的樣品)以生理鹽水10倍稀釋后作為陽性血清，健康大菱鲆血清以生理鹽水10倍稀釋后作為陰性血清，用生理鹽水作為對照。取100 μL樣品滴加在半成品試紙的樣品墊區，5 min內可裸眼觀察結果，同時用BioDot-TSR 3000讀條儀對檢測線進行讀值，量化結果。

2)試紙檢測靈敏度分析。將已制備的大菱鲆抗BSA抗血清從1︰100開始以生理鹽水倍比稀釋以檢驗試紙的靈敏度，健康大菱鲆血清以生理鹽水100倍稀釋后作為陰性血清，用生理鹽水作為對照。取100 μL樣品滴加在半成品試紙的樣品墊區，5 min內可裸眼觀察結果，同時用BioDot-TSR 3000讀條儀對檢測線進行讀值，量化結果。

3 結果與分析

3．1 大菱鲆血清IgM的純化及其兔抗血清的純化

大菱鲆血清經過鹽析粗提和過分子篩純化后，再經SDS-PAGE檢驗純化后的血清IgM有2個條帶，分子量分別是76 kD和27 kD，代表免疫球蛋白的重鏈和輕鏈(見圖2)，結果與文獻［6］報道一致。

圖2 純化的大菱鲆血清免疫球蛋白IgM的SDS－PAGE圖譜Fig．2 SDS －PAGE analysis of IgM purified from turbot serum

將純化的大菱鲆血清IgM免疫新西蘭白兔，經過4次免疫后，以間接ELISA法檢測兔抗血清效價為1︰256000，將此兔抗血清進一步純化獲得其IgG用于制備檢測試紙，檢測其效價為1︰128000。

3．2 間接ELISA法檢測大菱鲆BSA免疫血清效價

大菱鲆經過BSA免疫后，第4周開始產生特異性抗體，抗體效價為1︰800;第5周至第7周抗體水平逐步升高;第8周開始抗體水平升高到1︰51200并維持在這一水平至第10周。

3．3 試紙條的特異性檢測

以組裝后的試紙條檢驗制備保存的大菱鲆BSA免疫血清，結果顯示，從大菱鲆免疫后第4周開始的血清樣品經試紙檢測，其檢測線出現明顯的顯色反應，即陽性反應;試紙條檢測線的顏色反應隨著大菱鲆免疫時間的延長而顯色且逐漸加深，其變化趨勢與間接ELISA法檢測結果一致;其中第10周的顯色與第9周相比較顯得略弱，這與ELISA法檢測時第10周的顯色相對光密度讀值與第9周比較略低相一致。試紙條與健康大菱鲆血清和生理鹽水均呈陰性反應。試紙條反應結果經BioDot-TSR 3000讀條儀進行讀值量化后見表1。大菱鲆BSA抗體檢測試紙的陽性和陰性兩個檢測代表結果如圖3所示。

表1 檢測不同樣品后試紙條檢測線的相對光密度值Table 1 The relative optical density(ROD)of test lines on the strip with different samples

圖3 大菱鲆BSA抗體檢測試紙Fig．3 An immunochromatographic strip for the serological detection of antibodies against BSA in turbot，Scophthalmus maximus

3．4 試紙條的靈敏性檢測

組裝后的試紙條與1︰100開始倍比稀釋的大菱鲆BSA免疫血清反應，隨著稀釋倍數的增加，裸眼可見試紙條的顏色反應逐漸減弱。以大菱鲆免疫后第九周血清為例，當血清稀釋到1︰25600時顯色為弱陽性，繼續稀釋則不見顯色反應，試紙條檢測結果與間接ELISA法檢測結果相當。試紙條與健康大菱鲆血清和生理鹽水均呈陰性反應。試紙條反應經BioDot-TSR 3000讀條儀進行讀值量化后結果見表2。

表2 檢測不同稀釋梯度的樣品其試紙條檢測線的相對光密度值Table 2 ROD of test lines on the strip with different dilutions of the samples

4 總結與討論

當前，水產養殖業正處于高度發達時期，研究和建立一種簡易、快捷的魚類早期疾病檢測方法是業界最為迫切的需求之一。研究發現，在魚類免疫系統中有4種免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)，即IgM、IgD、IgT 和 IgZ［7］，其中 IgM 是在真骨魚類中發現最早、研究最多的Ig，也就是當前魚類抗體檢測的主要Ig。因此，研究人員可以通過對IgM的檢測實現對魚類疾病的早期診斷。抗體檢測的優勢相對于抗原檢測，因可以在疾病的潛伏期內發現其蹤跡，而受到人們的高度重視。然而，對于IgM的檢測，現有方法的最大不足是步驟繁瑣、周期長，且需專業人員操作。為此，養殖生產一線人員特別渴望獲得一種操作簡便、可以現場快速檢測的方法，以實現真正意義上的魚病早發現、早診斷。

據有關文獻報道，膠體金具有肉眼可以觀察到的紅色、與多種生物大分子(包括抗原、抗體)結合后不會影響其活性等優點，而被廣泛應用于標記組織和細胞、電鏡分析、免疫斑點滲濾和免疫層析等領域［8～11］。近年來，由膠體金標記物與膜載體相結合而構建完成的膠體金免疫層析檢測試紙，其靈敏性已在畜禽疾病檢測中得到證實，并且迅速發展成為一種簡便、實用的病害檢測方法而被畜禽界普遍采用。這種檢測試紙現已實現了商品化生產，并顯示出巨大的市場潛力［3］。

本研究吸取了畜牧業疾病檢測試紙的基本原理和方法，首次制備的魚類疾病檢測試紙已經成功地應用于水生動物——大菱鲆抗BSA抗體的檢測，其檢測的特異性和靈敏性與ELISA檢測水平相當。由此可見，該項快速檢測技術的建立將可在海水魚類養殖中普遍推廣應用，其不僅可為魚類疾病的早期檢測提供新技術、新方法，而且可以為疫苗免疫效果的評價提供一種比過去更為便捷、直觀的新方法。

文章建立的大菱鲆BSA抗體檢測試紙之所以具有較高的特異性和敏感性，分析其原因主要與制作試紙所用的材質及其處理方法、膠體金標記抗體時采用的pH值和標記的蛋白濃度有關［12］。本研究選取玻璃纖維素膜作為結合墊，將其安置于層析系統的中間，其網格均勻且非特異性吸附低，并具有一定的硬度，能夠很好地負載膠體金標記物和待檢測樣品而不致被吸附;同時對結合墊進行封閉處理后，可以更好地降低其非特異性吸附及非特異性反應。本試驗發現，當用豬血清IgG對玻璃纖維素膜進行封閉處理時，檢測試紙會發生非特異性反應——即檢測生理鹽水時檢測線會顯色;當用正常兔血清進行封閉處理時，則不會發生非特異性反應。另外，膠體金與標記蛋白之間的電荷引力是實現標記的重要作用力之一，當膠體金溶液的pH值接近標記蛋白的等電點時，兩者的吸附力最強;標記蛋白的濃度是否合適也是影響標記的一個重要因素，蛋白濃度過高會造成一定的浪費，同時容易引起試紙的拖帶現象，反之則會導致膠體金標記不完全，從而降低試紙的靈敏度，并可能出現假陽性現象。通過梯度標記試驗，反復比較不同標記pH值和標記蛋白的濃度，確定膠體金溶液的pH值為8．5，且多抗的IgG標記濃度為0．3 mg/mL時，即可達到最佳標記效果。

檢測實驗證明，筆者等制備的魚類疾病專用檢測試紙使用方便，檢測快速，可裸眼即時判讀結果而無需特殊操作技能和儀器設備的輔助。因此，在養殖生產實踐中可用作對疫苗的應用效果進行現場快速評估，也可對病害的發生過程進行實時跟蹤檢測。但是，目前尚存在如下問題期待以后的研究來解決:

1)該試紙尚不能區分所檢測的抗體是由疫苗誘導抑或自然發病所產生，如果已知魚體接種過疫苗，則可應用該試紙評估抗體產生情況;如已知魚體未接種過疫苗，應用該試紙檢出抗體則說明魚體正感染此病或者曾經感染過此病。至此目前只能結合魚體平時表現進行分析再做出最終判斷，實現免除實驗室繁瑣的檢驗過程，為提高病害防控能力贏得寶貴時間。

2)實驗中，試紙的顏色反應會隨魚體抗體水平的升高而逐漸加深，即試紙的顏色反應與待檢抗體水平存在一定的線性關系，只通過裸眼觀察尚無法進行定量判斷;所采用的BioDot-TSR 3000讀條儀雖然可以量化結果，但是操作復雜，需要有專業技能，且不便攜帶，限制了野外配合檢測試紙的操作與應用。因此，今后需開發便攜式試紙條閱讀器，以便為終端用戶提供更多的選擇，方可達到獲得定性檢測結果的同時也可獲得定量檢測的效果，如結合網絡運用，則可實現數據的遠程傳送。

3)制備的檢測試紙雖已達到了ELISA法的檢測水平，但尚不能在魚體免疫初期即當抗體水平處于較低水平的狀態下檢出結果，故今后尚需進一步提高試紙檢測的靈敏度，如采用單克隆抗體技術則有可能更精準地捕獲靶目標，或者采用信號放大系統，如生物素-親和素系統或免疫金銀染色法進行銀加強等，結合使用簡易檢測儀器，便可進一步提高檢測靈敏度，以拓寬其檢測范圍。

5 結語

筆者等應用膠體金免疫層析試紙快速檢測技術，首次在大菱鲆上成功研制出抗體檢測試紙(此抗體檢測試紙已獲得國家實用新型專利授權，專利號:ZL201120131593．7)，表明該項技術可以推廣應用于魚類病害的抗體檢測，還可以設計改造制作成病原檢測試紙，為水產養殖動物疾病(包括真菌性、細菌性、病毒性及寄生蟲性等疾病)的早期診斷和治療提供快捷手段。該項技術的誕生使養殖生產現場檢測與監測疾病早期發生成為可能，其理論與技術經濟價值很高，應用前景廣闊。為了使其在水產養殖領域能夠達到快捷、簡便、高效的應用階段，應該在今后進一步開展精準化檢測試紙的研制與建立。

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