微生物產(chǎn)3-羥基丙酸研究進展

程 嫚,羅 暉,常雁紅,劉曉惠(.北京科技大學化學與生物工程學院,北京00083;.北京科技大學土木與環(huán)境工程學院,北京00083)

微生物產(chǎn)3-羥基丙酸研究進展

程 嫚1,2,羅 暉1,常雁紅2,劉曉惠1
(1.北京科技大學化學與生物工程學院,北京100083;2.北京科技大學土木與環(huán)境工程學院,北京100083)

介紹了3-羥基丙酸的性質(zhì)、用途以及研究歷程,討論了采用誘變法和基因工程法對產(chǎn)3-羥基丙酸菌種進行改造的機理以及產(chǎn)物分離純化等方面的研究進展。

3-羥基丙酸;基因工程法;誘變法;分離純化

3-羥基丙酸(3-Hydroxypropionic acid,3-HP),分子式C3H6O3,化學索引號503-66-2,為三碳無手性β-羥基羧酸,無色、無味,易溶于水、醇等有機溶劑[1]。3-HP和乳酸是同分異構(gòu)體,由于羥基位置的不同,3-HP的化學性質(zhì)更為活潑。3-HP是一種重要的功能性有機酸,利用已有的成熟催化技術(shù),通過氧化、脫水、酯化反應(yīng)等可以將其轉(zhuǎn)化為多種重要的化學物質(zhì),如丙烯酸、丙二酸、聚3-HP等,3-HP還可以作為食品或飼料的添加劑和防腐劑。由于3-HP應(yīng)用廣泛,近年來已成為研究熱點,美國能源部也將其列為12種最具開發(fā)潛力的化工產(chǎn)品之一[2]。

目前,3-HP的生產(chǎn)方法有化學法和微生物法,化學法使用不可再生資源、副產(chǎn)物多、分離困難、污染嚴重,而微生物法可以有效彌補這些缺點,因此,以微生物法生產(chǎn)3-HP成為大勢所趨。作者在此綜述了微生物產(chǎn)3-HP的研究進展。

1 微生物法產(chǎn)3-HP的研究歷程

早在20世紀70年代,人們就發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)3-HP的野生菌株,但普遍產(chǎn)率低、生產(chǎn)周期長,應(yīng)用前景非常有限。隨著基因重組技術(shù)的日益成熟,近年來人們開始研究構(gòu)建基因工程菌來生產(chǎn)3-HP,微生物產(chǎn)3-HP的能力得到明顯提高,部分研究狀況見表1。

2 產(chǎn)3-HP菌種的選育與構(gòu)建

微生物法生產(chǎn)3-HP的關(guān)鍵在于選育高產(chǎn)的菌種,現(xiàn)有的菌種改造方法主要有誘變法和基因工程法。其中誘變法主要是針對假絲酵母野生菌株,基因工程法主要是構(gòu)建以葡萄糖或甘油為底物的重組菌株。

2.1 誘變法提高微生物產(chǎn)3-HP的能力

在一些自養(yǎng)微生物體內(nèi)[6],3-HP作為一種中間代謝產(chǎn)物存在于某些代謝途徑中,但一般不是微生物生長所必需的物質(zhì),所以在菌體中不能大量積累,其過度積累會破壞微生物細胞內(nèi)的代謝平衡。為了提高菌株的3-HP積累量,需要對菌種進行改造,誘變法就是對產(chǎn)3-HP野生菌株進行改造的一種常規(guī)方法。

早在1982年,Hasegawa等[5]分離出一株能夠產(chǎn)3-HP的皺褶假絲酵母,以亞硝基胍為誘變劑,采用以葡萄糖和丙酸分別為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基,篩選不能同化丙酸的突變株,最終得到能夠高產(chǎn)β-羥基異丁酸和3-HP的突變體,以葡萄糖和丙酸作為碳源進行發(fā)酵,3-HP產(chǎn)量達到40.0 g·L-1。

近年來,國內(nèi)研究者開始關(guān)注能夠產(chǎn)3-HP的野生菌株,主要以假絲酵母為主。朱建航等[13]分階段控制皺褶假絲酵母突變株發(fā)酵過程的p H值及糖含量等參數(shù),3-HP的最終產(chǎn)量達到20.0 g·L-1。范煒煒等[9]對皺褶假絲酵母進行誘變育種,3-HP產(chǎn)量達到8.88 g·L-1。諸葛斌等[19]對假絲酵母進行復合誘變,在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下,3-HP產(chǎn)量達到30.0 g· L-1。

Hasegawa等[5]提出了皺褶假絲酵母體內(nèi)可能存在的產(chǎn)3-HP的途徑,見圖1。

表1 微生物產(chǎn)3-HP的部分研究狀況Tab.1 Some research of 3-HP production by microorganisms

圖1 皺褶假絲酵母體內(nèi)產(chǎn)3-HP途徑Fig.1 The pathway of producing 3-HP in Candida rugosa

2011年,Zhou等[21]根據(jù)?；鵆o A脫氫酶保守序列將皺褶假絲酵母中的丙酰Co A脫氫酶克隆出來,并在Pichia pastoris GS115中表達出重組蛋白,分析了蛋白的生化性質(zhì),部分證實了在皺褶假絲酵母中存在如圖1所示的3-HP合成途徑。

在此途徑中,為了提高3-HP的積累量,需要關(guān)注菌株的3-HP降解酶。一般認為,降解3-HP的酶為3-羥基丙酸脫氫酶。Hasegawa等[5]所篩選出來的高產(chǎn)3-HP的突變株,其3-羥基丙酸脫氫酶的酶活幾乎為0。Yao等[22]從蠟狀芽孢桿菌中獲得β-羥基異丁酸脫氫酶基因,并在大腸桿菌中表達,發(fā)現(xiàn)該酶能夠使3-HP脫氫,但是,對于皺褶假絲酵母中存在的β-羥基異丁酸脫氫酶是否也能使3-HP脫氫還需要進一步研究證實。

2.2 構(gòu)建基因工程菌產(chǎn)3-HP

2.2.1 以葡萄糖為底物

葡萄糖是構(gòu)成生物質(zhì)的重要單元,開發(fā)以葡萄糖為底物的產(chǎn)3-HP菌株是以生物質(zhì)為原料基礎(chǔ)的現(xiàn)代生物煉制技術(shù)的重要發(fā)展方向。美國卡吉爾公司在研究由葡萄糖生產(chǎn)3-HP方面做了大量工作,在2002年申請的專利中提出了以葡萄糖為底物產(chǎn)3-HP的途徑,并從不同微生物體內(nèi)獲得途徑所需的酶基因,構(gòu)建了基因工程菌,3-HP產(chǎn)量最高達到20.0 g·L-1[8]。

到目前為止,根據(jù)微生物體內(nèi)的代謝途徑,學者共提出了7條由葡萄糖到3-HP的途徑[23](如圖2所示),并分析了每條途徑的能量代謝、輔酶再生等情況。由于產(chǎn)物的合成和輸出細胞需要ATP,并且需要達到一定的平衡,而圖2所示的各條途徑生成和消耗的ATP的量不同,因此3-HP的生成量差別很大。其中乳酸途徑的理論轉(zhuǎn)化率很高。該途徑涉及3個酶:丙酰Co A轉(zhuǎn)移酶(PCT)、乳酰Co A脫水酶(LCD)和3-羥基丙酰Co A脫水酶(OS19)。在此途徑中,由于LCD嚴格厭氧[24],所以構(gòu)建的基因工程菌需要厭氧發(fā)酵。乳酸作為代謝中間產(chǎn)物和3-HP同時存在于發(fā)酵液中,由于它們性質(zhì)相似而較難分離,因此,3-HP的 分離純化是此途徑需要解決的一個難題。

圖2 以葡萄糖為底物產(chǎn)3-HP的代謝途徑Fig.2 The metabolic pathways of producing 3-HP with glucose as substrate

2.2.2 以甘油為底物

21世紀初,由于生物柴油的大量生產(chǎn),甘油作為一種廉價的副產(chǎn)物需要加以利用,因此近年來利用甘油生產(chǎn)3-HP的研究得到相當?shù)闹匾暋Ｈ藗円话阃ㄟ^構(gòu)建基因工程菌來代謝甘油產(chǎn)生3-HP,其主要機理是:甘油在微生物體內(nèi)發(fā)生氧化還原反應(yīng),氧化反應(yīng)為還原反應(yīng)提供ATP和NAD+[25～27],如圖3所示。

圖3 由甘油產(chǎn)3-HP機理Fig.3 The mechanism of producing 3-HP from glycerol

由圖3可知,甘油產(chǎn)3-HP需要兩種酶:甘油脫水酶和醛脫氫酶。甘油脫水酶需要以VB12為輔酶催化甘油生成3-羥基丙醛,醛脫氫酶催化3-羥基丙醛(3-HPA)生成3-HP和NADH。甘油脫水酶在催化過程中很不穩(wěn)定,是該途徑的限速酶,甘油會抑制該酶的活性,從而降低3-HP的產(chǎn)量,解除該抑制作用,就可以有效提高3-HP產(chǎn)量。權(quán)國燕等[18]構(gòu)建了重組大腸桿菌,以甘油脫水酶再激活因子對甘油脫水酶進行激活,3-HP產(chǎn)量提高了6.4倍。王鳳寰等[28]構(gòu)建了重組肺炎克雷伯桿菌轉(zhuǎn)化甘油進行3-HP和1,3-丙二醇的共發(fā)酵,不但實現(xiàn)了NADH的循環(huán)再生,還有效地減少了有毒中間產(chǎn)物3-HPA的積累,3-HP最終產(chǎn)量為5 g·L-1,同時產(chǎn)生74.5 g·L-1的1,3-丙二醇。Rathnasingh等[14]構(gòu)建了以甘油為底物的重組菌,其3-HP的產(chǎn)量非常可觀,達到38.7 g·L-1,但是由于酶活丟失及氧化還原反應(yīng)不平衡,轉(zhuǎn)化率未能達到期望值。因此,還需要進一步研究NAD+再生系統(tǒng)以及提高酶活的方法。

由于構(gòu)建基因工程菌涉及到多種基因,并且這些基因在宿主細胞中的穩(wěn)定性、酶的活性表達以及細胞代謝流量調(diào)控等在實際生產(chǎn)中面臨著巨大挑戰(zhàn),因此目前該技術(shù)尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),仍有許多技術(shù)問題有待解決。

3 3-HP的分離與純化

由于發(fā)酵液成分復雜,因此3-HP的分離純化是微生物法生產(chǎn)3-HP的一個難題,但迄今為止,其研究重點仍集中在菌株的構(gòu)建與改造,很少有針對發(fā)酵液中3-HP分離的文獻報道。Meng等[29]研究了3-HP和丙烯酸等有機酸的混合物的分離并申請了專利,以乙酸乙酯或其它有機物為萃取劑,以逆流萃取的方式分離純化丙烯酸及3-HP,將萃取后的有機相蒸餾或者用水反萃取,實現(xiàn)了萃取劑的循環(huán)利用。Jump[30]采用電滲析方法對3-HP進行分離回收,在分離過程中將溶液中的3-羥基丙酸鈉鹽進行濃縮并轉(zhuǎn)化為3-HP,該技術(shù)還可以有效地分離溶液中的3-HP和葡萄糖,顯示了良好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)語

微生物法生產(chǎn)3-HP以其污染小、副產(chǎn)物少等特點優(yōu)于化學法,而且構(gòu)建的重組菌利用的是可再生資源,是未來的發(fā)展方向。但迄今為止,微生物發(fā)酵產(chǎn)3-HP的產(chǎn)量最高只有30～40 g·L-1,為了進一步提高產(chǎn)量,實現(xiàn)該方法的技術(shù)和經(jīng)濟可行性,必須解決微生物法存在的一些問題,如高產(chǎn)物濃度耐受菌株的選育[31]、基因工程菌代謝流的調(diào)控、菌株底物轉(zhuǎn)化率的提高以及產(chǎn)物的高效低成本分離技術(shù)等,這也是科研人員下一步將要重點解決的問題。

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Research Progress of Producing 3-Hydroxypropionic Acid by Microorganisms

CHENG Man1,2,LUO Hui1,CHANG Yan-hong2,LIU Xiao-hui1
(1.School of Chemistry and Biological Engineering,University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083,China;2.School of Civil and Environmental Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China)

As a kind of important chemical intermediate,3-hydroxypropionic acid has gained more and more attention by researchers.In this paper,the properties,applications and developing process of 3-hydroxypropionic acid were introduced.The research progress of the mechanisms of the strains producing 3-hydroxypropionic acid by means of genetic engineering method and traditional mutagenesis method,and the product separation and purification were mainly reviewed.

3-hydroxypropionic acid;genetic engineering method;mutagenesis method;separation and purification

TQ 921.7 Q 819

A

1672-5425(2012)11-0009-004

10.3969/j.issn.1672-5425.2012.11.003

2012-07-15

程嫚(1986-),女,河南蘭考人,碩士研究生,研究方向:生物化工,E-mail:chengman-123@163.com;通訊作者:羅暉,副教授,E-mail:luohui@ustb.edu.cn。