卷煙煙氣中性紅細胞毒性試驗不確定度評定

黃海濤,管 瑩,周 嵐,高 茜,米其利,李雪梅,夭建華(云南煙草科學研究院,云南昆明650106)

卷煙煙氣中性紅細胞毒性試驗不確定度評定

黃海濤,管 瑩,周 嵐,高 茜,米其利,李雪梅,夭建華
(云南煙草科學研究院,云南昆明650106)

研究了煙草及煙草制品煙氣安全性生物學評價中性紅細胞毒性試驗的不確定度評定方法,分析和識別測量過程中不確定度的來源,較為全面地評定了測量不確定度。結果表明,測量結果的不確定度主要來源于測量重復性所引起的不確定度。

不確定度評定;中性紅細胞毒性試驗;煙草及煙草制品;煙氣安全性;生物學評價

測量不確定度在計量標準考核中具有核心作用,它是評價檢測結果可信性、可比性和可接受性的重要指標,中國實驗室國家認可委(CNAL)要求經其認可的檢測實驗室必須建立測量不確定度的評定程序,并有能力對每一項數值要求的測量結果進行測量不確定度的評定[1,2]。目前,煙草科技工作者已按照CNAL的要求對卷煙部分物理指標的測定和煙草中一些化學成分的測定進行了不確定度的評定,但是關于煙草及煙草制品生物學檢測不確定度的評定卻未見報道。近10年來,中性紅細胞毒性試驗方法被國內外煙草公司廣泛用于煙草及煙草制品的安全性評價。為了在測量數據的處理、測量結果的表達和測定結果質量評定等方面更具科學性和權威性,作者根據《測量不確定度評定與表示》(JJF 1059-1999)的相關規定,對煙草及煙草制品煙氣安全性生物學評價中性紅細胞毒性試驗[3]的不確定度進行了測量和評定。

1 實驗

1.1 材料、試劑及儀器

中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞),中國科學院昆明細胞庫。

DMEM細胞培養基(選擇含L-谷氨酸、不含丙酮酸鈉的類型)、RPM1640細胞培養基、中性紅染料、青霉素-鏈霉素混合液(1000 U·m L-1)、胰蛋白酶,以上物質均在(4±1)℃保存;胎牛血清,(-20±1)℃保存。

二甲基亞砜(細胞培養級)、臺盼藍(分析純)、甲醛(分析純)、十二烷基硫酸鈉(分析純)、冰醋酸(分析純)、無水乙醇(分析純)。

二級生物安全柜、倒置顯微鏡、二氧化碳培養箱[(37±1)℃,5%CO2]、酶標儀、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、p H計、微孔板振蕩器。

1.2 測定原理

中性紅以離子擴散方式進入細胞膜,并與溶酶體基質中的陰離子部分結合。中性紅進入并在細胞內積聚的過程要求有完整的細胞膜,當細胞膜和溶酶體膜中毒受傷時就會導致中性紅的進入下降。細胞內中性紅的攝入量與培養體系中細胞的存活率呈正相關。

在進行卷煙煙氣安全性生物學評價的中性紅細胞毒性試驗時,用受試樣品處理CHO細胞,向處理后的CHO細胞中加入中性紅溶液,用酶標儀在540 nm波長下測定空白、樣品、對照物中含有萃取中性紅的溶液的吸光度值,從而計算出細胞抑制率和半數細胞致死劑量。

1.3 測定過程

測定過程如下:

1.4 數學模型

IC50=lg[lg B+d×(b-50)/(b-a)]-1

式中:ODn、OD0、ODc為樣品、空白樣品、細胞對照OD值;B為高于50%抑制率的劑量;d為兩個相鄰劑量的對數差;b為B劑量的抑制率(＞50%);a為A劑量的抑制率(＜50%)。

2 結果與討論

2.1 不確定度來源識別

由于條件所限,煙氣樣品制備過程和CHO細胞懸液制備過程中的不確定度在此不作考慮。根據本方法的測定原理和數學模型,IC50主要由細胞抑制率計算得到,細胞抑制率由吸光度值計算得到,而吸光度值由酶標儀自動測定完成。可見本方法的測量不確定度主要與儀器準確度、儀器示值誤差產生的不確定度和樣品重復操作過程引起的吸光度值的不確定度有關。由儀器校準結果可知,儀器的準確度較好(吸光度值準確度≤±0.03),故由儀器準確度引入的不確定度分量可以忽略不計。綜上所述,將從儀器示值誤差產生的不確定度和樣品重復操作過程引起的吸光度值的不確定度對本方法的測量不確定度進行評估。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 樣品吸光度值引入的不確定度分量

2.2.1.1 樣品吸光度值測量重復性引入的標準不確定度分量

共進行了7次重復性試驗,所得樣品吸光度值分別為0.429、0.427、0.468、0.507、0.454、0.560、0.316,平均吸光度值為0.452。

單次的測量標準偏差為:

在日常分析中,測定兩份樣品報告平均值,故平均值的標準偏差應為:

測量重復性引入的相對標準不確定度為:

2.2.1.2 酶標儀示值誤差引入的不確定度分量

按照JJG 861-2007《酶標分析儀檢定規程》對儀器進行檢定,獲得線性誤差為2.5%,按矩形(均勻)分布計算得到酶標儀示值誤差引入的相對不確定度為: 2.2.1.3 兩種分量合成得到樣品吸光度值引入的不確定度

2.2.2 空白樣品吸光度值引入的不確定度分量

2.2.2.1 空白樣品吸光度值測量重復性引入的標準不確定度分量

共進行了7次重復性試驗,所得空白樣品吸光度值分別為0.0715、0.0722、0.0673、0.0713、0.0715、0.0673、0.0753,平均吸光度值為0.0709。

單次的測量標準偏差為:

在日常分析中,測定兩份樣品報告平均值,故平均值的標準偏差應為:

測量重復性引入的相對標準不確定度為:

2.2.2.2 酶標儀示值誤差引入的不確定度分量

按照JJG 861—2007《酶標分析儀檢定規程》對儀器進行檢定,獲得線性誤差為2.5%,按矩形(均勻)分布計算得到酶標儀示值誤差引入的相對不確定度為:

2.2.2.3 兩種分量合成得到空白樣品吸光度值引入的不確定度

2.2.3 細胞對照吸光度值引入的不確定度分量

2.2.3.1 細胞對照吸光度值測量重復性引入的標準不確定度分量

共進行了7次重復性試驗,所得細胞對照樣品吸光度值分別為1.142、1.148、1.124、1.231、1.232、1.205、0.823,平均吸光度值為1.129。

單次的測量標準偏差為:

在日常分析中,測定兩份樣品報告平均值,故平均值的標準偏差應為:

測量重復性引入的相對標準不確定度為:2.2.3.2 酶標儀示值誤差引入的不確定度分量

按照JJG 861-2007《酶標分析儀檢定規程》對儀器進行檢定,獲得線性誤差為2.5%,按矩形(均勻)分布計算得到酶標儀示值誤差引入的相對不確定度為:

2.2.3.3 兩種分量合成得到細胞對照吸光度值引入的不確定度

2.2.4 細胞抑制率計算公式中分子(ODn-OD0)的合成相對不確定度

2.2.5 細胞抑制率計算公式中分母(ODc-OD0)的合成相對不確定度

2.2.6 細胞抑制率的合成相對不確定度

2.2.7 細胞抑制率的合成標準不確定度

當劑量為100μg·m L-1時的7次抑制率測定結果分別為66.56%、66.99%、62.08%、62.41%、67.04%、56.65%、67.87%,平均值為64.23%。

2.2.8 擴展不確定度

取包含因子k=2,擴展不確定度為:

按照該方法測定受試樣品的細胞抑制率,報告兩份樣品測定結果的平均值,細胞抑制率為64.23%時,其擴展不確定度為18.62%。

2.3 討論

通過以上計算和分析可以看出,煙草及煙草制品煙氣安全性生物學評價中性紅細胞毒性試驗的不確定度主要來源于測量重復性所引起的不確定度,儀器示值誤差產生的不確定度很小。其中,空白樣品吸光度值測量重復性引入的不確定度(2.61%)明顯小于細胞對照吸光度值測量重復性引入的不確定度(8.21%),而樣品的加入對吸光度值測量重復性引入的不確定度(11.00%)僅稍高于細胞對照吸光度值測量重復性引入的不確定度(8.21%)。也就是說在該試驗中細胞的數量和狀態對測量不確定度的影響是最大的,要想進一步降低測量的不確定度需在試驗過程中對細胞狀態進行有效的監控。

3 結論

研究了煙草及煙草制品煙氣安全性生物學評價中性紅細胞毒性試驗的不確定度評定方法,分析和識別測量過程中不確定度的來源,較為全面評定了測量不確定度。結果表明,測量結果不確定度主要來源于測量重復性所引起的不確定度。

[1] 國家質量技術監督局計量司.測量不確定度評定與表示指南[Z].北京:中國計量出版社,2000.

[2] 中國實驗室國家認可委員會.化學分析中不確定度的評估指南[Z].北京:中國計量出版社,2002.

[3] 中國煙草總公司企業標準YQ2-2011,煙草及煙草制品煙氣安全性生物學評價第1部分:中性紅細胞毒性法[S].

The Uncertainty Assessment of Neutral Red Uptake Assay of Tobacco Smoke

HUANG Hai-tao,GUAN Ying,ZHOU Lan,GAO Qian,MI Qi-li,LI Xue-mei,YAO Jian-hua (Yunnan Academy of Tobacco Science,Kunming 650106,China)

The uncertainty assessment method of tobacco and tobacco products-biological evaluation of tobacco smoke-neutral red uptake assay was studied in this article.The factors of uncertainty during the measurement were analyzed and identified.It presented a relatively comprehensive assessment of measurement uncertainty.The results showed that the uncertainty was mainly caused by the uncertainty of the determination repeatability.

the uncertainty assessment;neutral red uptake assay;tobacco and tobacco products;tobacco smoke safety;biological evaluation

TS 416

A

1672-5425(2012)11-0068-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2012.11.019

云南省中煙工業公司項目(2011JC02),云南省煙草化學創新團隊建設項目(2009CI014)

2012-07-05

黃海濤(1975-),女,福建人,碩士,助理研究員,主要從事煙用添加劑安全性評價研究,E-mail:1696754981@qq.com;通訊作者:夭建華,副研究員,E-mail:jhyao_2007@126.com。