粘質沙雷氏菌代謝產物靈菌紅素的鑒定

朱雄偉,徐智鵬,蘇騰甲,陳杏洲,張 楠,張佑紅,李衛朋(武漢工程大學化工與制藥學院綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室,湖北武漢430074)

粘質沙雷氏菌代謝產物靈菌紅素的鑒定

朱雄偉,徐智鵬,蘇騰甲,陳杏洲,張 楠,張佑紅,李衛朋
(武漢工程大學化工與制藥學院綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室,湖北武漢430074)

從檸檬酸廠糖化車間酸性土壤中篩選得到一株產紅色素的粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZSG,菌株發酵液經酸性甲醇萃取、濃縮、硅膠柱層析、薄層色譜和柱色譜等分離純化后,得到靈菌紅素純品,并采用紫外可見吸收光譜、紅外光譜、液質聯用分析對其結構進行了表征。

粘質沙雷氏菌;靈菌紅素;紫外可見吸收光譜;紅外光譜;液質聯用

靈菌紅素,又名靈菌素、靈桿菌素,是一類含甲氧基吡咯骨架結構的天然紅色素,是由多種放線菌、沙雷氏菌、鏈霉菌屬、假單胞菌屬等產生的次級代謝產物[1,2]。根據其側鏈基團結構的不同,可分為靈菌紅素、間環丙菌素、十一烷基靈菌紅素、壬烷基靈菌紅素和環丙烷靈菌紅素等系列結構類似物。

靈菌紅素呈暗紅色,綠色反光,熔點151～152℃,屬于脂溶性色素,易溶于甲醇、丙酮、氯仿、苯、DMF和DMSO,幾乎不溶于水[3]。靈菌紅素對光不穩定,需要避光保存。靈菌紅素受p H值的影響較大,在酸性環境中能保存較長的時間,在堿性條件下則不穩定[4]。

雖然目前關于靈菌紅素的化學合成研究取得了一定的成果,但受其化學合成工藝的復雜性等多種因素的限制以及人們對綠色天然的追求,目前靈菌紅素的生產以生物合成為主。因此對產靈菌紅素菌種的開發及發酵工藝的研究具有非常重要的意義。

作者從檸檬酸廠糖化車間酸性土壤中篩選得到一株產紅色素的粘質沙雷氏菌ZSG,并對其發酵培養的代謝產物進行了分析。

1 實驗

1.1 菌株與培養基

粘質沙雷氏菌,從檸檬酸廠糖化車間酸性土壤中篩選獲得并保藏。

固體培養基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.5%,瓊脂2%。

種子培養基:蛋白胨1.5%,蔗糖1%,吐溫-80 1%,NaCl 0.5%。

1.2 試劑與儀器

Agar瓊脂粉,日本;蛋白胨;其它化學試劑均為分析純。

UV1800型紫外可見分光光度計;Nexus470 FTIR型智能傅立葉紅外光譜儀;LTQ XL型高效液相色譜-線性離子阱質譜聯用儀。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

將菌株在裝液量50 m L/250 m L、搖床轉速160 r ·min-1、29℃下培養36 h后,取發酵液離心(10 000 r·min-1,10 min),棄上清,收集菌體,用蒸餾水洗滌2次。

1.3.2 紅色素的分離純化

將上述收集的菌體先用酸性甲醇萃取,萃取液經濃縮去溶劑后,再用乙酸乙酯溶解,低溫靜置;將沉淀混合物經硅膠柱層析(氯仿和乙酸乙酯洗脫)、去溶劑得到靈菌紅素粗產品;最后用薄層色譜和柱色譜進行再分,即得到靈菌紅素純品。

1.4 結構表征[5～8]

分別采用紫外可見吸收光譜、紅外光譜、液質聯用分析對所得靈菌紅素進行結構表征。

2 結果與討論

2.1 紫外光譜分析

將所得的靈菌紅素溶解于甲醇中,分別用HCl、 NaOH調p H值為3、10,在200～800 nm波長范圍內進行全波段掃描,結果見圖1。

圖1 靈菌紅素的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis Absorption spectra of prodigiosin obtained

由圖1可知,酸性條件下,所得靈菌紅素在535 nm左右有最大吸收峰,溶液為鮮紅色;堿性條件下,所得靈菌紅素在470 nm左右有最大吸收峰,溶液為橘黃色,與已報道的靈菌紅素的吸收光譜一致[9]。

2.2 紅外光譜分析

采用液膜法測定靈菌紅素的紅外光譜,紅外光譜能量為40 mW,波數范圍為400～4000 cm-1,結果見圖2。

圖2 靈菌紅素的紅外光譜Fig.2 FTIR Spectrum of prodigiosin

由圖2可知,所得靈菌紅素的紅外光譜的主要吸收峰分別為:3440.0 cm-1、2981.1 cm-1、2843.9 cm-1、1657.7 cm-1、1241.3 cm-1、1032.96 cm-1、713.0 cm-1。其中,3440.0 cm-1處強而稍寬的峰為N -H的伸縮振動峰;2981.1 cm-1處弱而尖的峰為CH(甲基、亞甲基、次甲基)的伸縮振動峰;1657.7 cm-1處稍弱的峰為環內C=C的伸縮振動峰;1032. 96 cm-1處強而尖的峰為C-O、C-N的伸縮振動峰; 713.0 cm-1處為(CH)n的平面搖擺振動吸收峰;這與文獻報道的靈菌紅素紅外光譜相一致[10]。

2.3 液質聯用圖譜分析

色譜條件:色譜柱為Liehrospher C18column (4.6 mm×250 mm),流動相為80%甲醇的水溶液,流速1 m L·min-1,柱溫30℃。

質譜條件:ESI-MS錐孔電壓60 V,毛細管電壓3.88 k V,離子源溫度120℃,脫溶劑溫度300℃。

所得靈菌紅素的液質聯用圖譜如圖3所示。

圖3 靈菌紅素的液質聯用圖譜Fig.3 LC-MS Spectra of obtained prodigiosin

由圖3a可知,在MS圖譜中有m/z 324.19[M+ H],據此判斷該色素的相對分子質量為323.19,與靈菌紅素分子量(C20H25N3O,M=323.1968)相同[11]。

由圖3c可知,通過LC-MS還可以得到離子碎片m/z 308、m/z 292、m/z 266、m/z 252、m/z 238、m/z 161和m/z 149等,與報道的靈菌紅素碎片數據基本一致[12]。

3 結論

從檸檬酸廠糖化車間酸性土壤中篩選得到一株產紅色素的粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZSG,菌株發酵液經酸性甲醇萃取、濃縮、硅膠柱層析、薄層色譜和柱色譜等分離純化后,得到靈菌紅素純品。經紫外可見吸收光譜、紅外光譜、液質聯用分析對其結構進行了表征。

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Identification of Metabolite Prodigiosin of Serratia Marcescens

ZHU Xiong-wei,XU Zhi-peng,SU Teng-jia,CHEN Xing-zhou,ZHANG Nan,ZHANG You-hong,LI Wei-peng (Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education,School of Chemical
Engineering and Pharmacy,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430074,China)

A red pigment-producing strain Serratia marcescens ZSG was isolated from the acidic soil of a citric acid plant saccharification workshop.By acidic methanol extraction,concentration,silica gel column chromatography,thin-layer chromatography and column chromatography,the pure prodigiosin was separated and purified from the fermentation broth,and its structure was characterized by UV-Vis,IR and LC-MS.

Serratia marcescens;prodigiosin;UV-Vis absorption spectrum;IR;LC-MS

TQ 920.6 O 657.7

A

1672-5425(2012)11-0080-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2012.11.022

國家自然科學基金資助項目(20876120)

2012-07-05

朱雄偉(1973-),男,湖北咸寧人,博士,講師,研究方向:生物工程與生物技術,E-mail:zhuslx@163.com。