粘質(zhì)沙雷氏菌代謝產(chǎn)物靈菌紅素的鑒定

朱雄偉,徐智鵬,蘇騰甲,陳杏洲,張 楠,張佑紅,李衛(wèi)朋(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室,湖北武漢430074)

粘質(zhì)沙雷氏菌代謝產(chǎn)物靈菌紅素的鑒定

朱雄偉,徐智鵬,蘇騰甲,陳杏洲,張 楠,張佑紅,李衛(wèi)朋
(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室,湖北武漢430074)

從檸檬酸廠糖化車間酸性土壤中篩選得到一株產(chǎn)紅色素的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZSG,菌株發(fā)酵液經(jīng)酸性甲醇萃取、濃縮、硅膠柱層析、薄層色譜和柱色譜等分離純化后,得到靈菌紅素純品,并采用紫外可見吸收光譜、紅外光譜、液質(zhì)聯(lián)用分析對其結(jié)構(gòu)進行了表征。

粘質(zhì)沙雷氏菌;靈菌紅素;紫外可見吸收光譜;紅外光譜;液質(zhì)聯(lián)用

靈菌紅素,又名靈菌素、靈桿菌素,是一類含甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)的天然紅色素,是由多種放線菌、沙雷氏菌、鏈霉菌屬、假單胞菌屬等產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1,2]。根據(jù)其側(cè)鏈基團結(jié)構(gòu)的不同,可分為靈菌紅素、間環(huán)丙菌素、十一烷基靈菌紅素、壬烷基靈菌紅素和環(huán)丙烷靈菌紅素等系列結(jié)構(gòu)類似物。

靈菌紅素呈暗紅色,綠色反光,熔點151～152℃,屬于脂溶性色素,易溶于甲醇、丙酮、氯仿、苯、DMF和DMSO,幾乎不溶于水[3]。靈菌紅素對光不穩(wěn)定,需要避光保存。靈菌紅素受p H值的影響較大,在酸性環(huán)境中能保存較長的時間,在堿性條件下則不穩(wěn)定[4]。

雖然目前關(guān)于靈菌紅素的化學(xué)合成研究取得了一定的成果,但受其化學(xué)合成工藝的復(fù)雜性等多種因素的限制以及人們對綠色天然的追求,目前靈菌紅素的生產(chǎn)以生物合成為主。因此對產(chǎn)靈菌紅素菌種的開發(fā)及發(fā)酵工藝的研究具有非常重要的意義。

作者從檸檬酸廠糖化車間酸性土壤中篩選得到一株產(chǎn)紅色素的粘質(zhì)沙雷氏菌ZSG,并對其發(fā)酵培養(yǎng)的代謝產(chǎn)物進行了分析。

1 實驗

1.1 菌株與培養(yǎng)基

粘質(zhì)沙雷氏菌,從檸檬酸廠糖化車間酸性土壤中篩選獲得并保藏。

固體培養(yǎng)基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.5%,瓊脂2%。

種子培養(yǎng)基:蛋白胨1.5%,蔗糖1%,吐溫-80 1%,NaCl 0.5%。

1.2 試劑與儀器

Agar瓊脂粉,日本;蛋白胨;其它化學(xué)試劑均為分析純。

UV1800型紫外可見分光光度計;Nexus470 FTIR型智能傅立葉紅外光譜儀;LTQ XL型高效液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

將菌株在裝液量50 m L/250 m L、搖床轉(zhuǎn)速160 r ·min-1、29℃下培養(yǎng)36 h后,取發(fā)酵液離心(10 000 r·min-1,10 min),棄上清,收集菌體,用蒸餾水洗滌2次。

1.3.2 紅色素的分離純化

將上述收集的菌體先用酸性甲醇萃取,萃取液經(jīng)濃縮去溶劑后,再用乙酸乙酯溶解,低溫靜置;將沉淀混合物經(jīng)硅膠柱層析(氯仿和乙酸乙酯洗脫)、去溶劑得到靈菌紅素粗產(chǎn)品;最后用薄層色譜和柱色譜進行再分,即得到靈菌紅素純品。

1.4 結(jié)構(gòu)表征[5～8]

分別采用紫外可見吸收光譜、紅外光譜、液質(zhì)聯(lián)用分析對所得靈菌紅素進行結(jié)構(gòu)表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜分析

將所得的靈菌紅素溶解于甲醇中,分別用HCl、 NaOH調(diào)p H值為3、10,在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行全波段掃描,結(jié)果見圖1。

圖1 靈菌紅素的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis Absorption spectra of prodigiosin obtained

由圖1可知,酸性條件下,所得靈菌紅素在535 nm左右有最大吸收峰,溶液為鮮紅色;堿性條件下,所得靈菌紅素在470 nm左右有最大吸收峰,溶液為橘黃色,與已報道的靈菌紅素的吸收光譜一致[9]。

2.2 紅外光譜分析

采用液膜法測定靈菌紅素的紅外光譜,紅外光譜能量為40 mW,波數(shù)范圍為400～4000 cm-1,結(jié)果見圖2。

圖2 靈菌紅素的紅外光譜Fig.2 FTIR Spectrum of prodigiosin

由圖2可知,所得靈菌紅素的紅外光譜的主要吸收峰分別為:3440.0 cm-1、2981.1 cm-1、2843.9 cm-1、1657.7 cm-1、1241.3 cm-1、1032.96 cm-1、713.0 cm-1。其中,3440.0 cm-1處強而稍寬的峰為N -H的伸縮振動峰;2981.1 cm-1處弱而尖的峰為CH(甲基、亞甲基、次甲基)的伸縮振動峰;1657.7 cm-1處稍弱的峰為環(huán)內(nèi)C=C的伸縮振動峰;1032. 96 cm-1處強而尖的峰為C-O、C-N的伸縮振動峰; 713.0 cm-1處為(CH)n的平面搖擺振動吸收峰;這與文獻報道的靈菌紅素紅外光譜相一致[10]。

2.3 液質(zhì)聯(lián)用圖譜分析

色譜條件:色譜柱為Liehrospher C18column (4.6 mm×250 mm),流動相為80%甲醇的水溶液,流速1 m L·min-1,柱溫30℃。

質(zhì)譜條件:ESI-MS錐孔電壓60 V,毛細管電壓3.88 k V,離子源溫度120℃,脫溶劑溫度300℃。

所得靈菌紅素的液質(zhì)聯(lián)用圖譜如圖3所示。

圖3 靈菌紅素的液質(zhì)聯(lián)用圖譜Fig.3 LC-MS Spectra of obtained prodigiosin

由圖3a可知,在MS圖譜中有m/z 324.19[M+ H],據(jù)此判斷該色素的相對分子質(zhì)量為323.19,與靈菌紅素分子量(C20H25N3O,M=323.1968)相同[11]。

由圖3c可知,通過LC-MS還可以得到離子碎片m/z 308、m/z 292、m/z 266、m/z 252、m/z 238、m/z 161和m/z 149等,與報道的靈菌紅素碎片數(shù)據(jù)基本一致[12]。

3 結(jié)論

從檸檬酸廠糖化車間酸性土壤中篩選得到一株產(chǎn)紅色素的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZSG,菌株發(fā)酵液經(jīng)酸性甲醇萃取、濃縮、硅膠柱層析、薄層色譜和柱色譜等分離純化后,得到靈菌紅素純品。經(jīng)紫外可見吸收光譜、紅外光譜、液質(zhì)聯(lián)用分析對其結(jié)構(gòu)進行了表征。

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Identification of Metabolite Prodigiosin of Serratia Marcescens

ZHU Xiong-wei,XU Zhi-peng,SU Teng-jia,CHEN Xing-zhou,ZHANG Nan,ZHANG You-hong,LI Wei-peng (Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education,School of Chemical
Engineering and Pharmacy,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430074,China)

A red pigment-producing strain Serratia marcescens ZSG was isolated from the acidic soil of a citric acid plant saccharification workshop.By acidic methanol extraction,concentration,silica gel column chromatography,thin-layer chromatography and column chromatography,the pure prodigiosin was separated and purified from the fermentation broth,and its structure was characterized by UV-Vis,IR and LC-MS.

Serratia marcescens;prodigiosin;UV-Vis absorption spectrum;IR;LC-MS

TQ 920.6 O 657.7

A

1672-5425(2012)11-0080-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2012.11.022

國家自然科學(xué)基金資助項目(20876120)

2012-07-05

朱雄偉(1973-),男,湖北咸寧人,博士,講師,研究方向:生物工程與生物技術(shù),E-mail:zhuslx@163.com。