姜黃素誘導雄性激素依賴性前列腺癌LNCaP多耐藥細胞凋亡

趙 雷

（長春中醫藥大學教務處，吉林 長春 130117）

姜黃素誘導雄性激素依賴性前列腺癌LNCaP多耐藥細胞凋亡

趙 雷

（長春中醫藥大學教務處，吉林 長春 130117）

前列腺癌細胞的多耐藥性（multidrug-resistance，MDR）常常導致臨床上前列腺腫瘤化療的失敗。研究耐藥機制，尋找分子靶點，研發高效、低毒的MDR抑制劑是目前面臨的挑戰。研究表明，化療藥物誘導凋亡耐受在前列腺腫瘤細胞MDR形成過程中起著十分重要的作用。因此，尋找前列腺癌多耐藥抑制劑，促進細胞凋亡可以在很大程度上降低前列腺癌MDR。

姜黃素（Curcumin，Cur）是一種從姜黃根莖中提取得到的黃色色素［1］。姜黃素有重要和廣泛的藥理作用，如降血脂、抗氧化、抗發炎［2］、抗動脈粥樣硬化等［3］。2004年時發現姜黃素能抑制HIV-1整合酶活性而用于艾滋病的臨床試驗。此外，抗癌是姜黃素的主要藥理活性之一，其抑制腫瘤的作用已在許多動物實驗中得到反復證實，其具體抗癌機制已成為近期研究熱點［4，5］。

NF-κB（nuclear factor-κB）是一種分布和作用均十分廣泛的真核細胞轉錄因子，通過多條信號通路與腫瘤細胞的多耐藥性相關［6］。王漪等2007年研究發現，白血病細胞中NF-κB調控 MDR1基因，參與耐藥逆轉［7］。研究表明，NF-κB、Bcl-2、p53和c-jun等分子與前列腺腫瘤細胞的發生和發展關系密切［8，9］。

本研究的目的在于研究姜黃素與NF-κB信號通路的聯系，及其誘導雄性激素依賴性前列腺癌LNCaP多耐藥細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株雄性激素依賴性前列腺癌細胞系LNCaP購自上海細胞庫，用DMEM培養基（含15%牛血清）在CO2培養箱中培養，消化傳代用0.25%胰蛋白酶液。多耐藥細胞的制備參考文獻［10］。

1.2 試劑姜黃素購自Sigma公司；總蛋白提取、總RNA提取試劑盒購自Promega。鼠源單克隆抗體：NF-κB抗體、磷酸化c－jun抗體、P-gp（P-glycoprotein）抗體、p53抗體、bcl-2抗體、GAPDH抗體購自ABCam。HRP標記羊抗鼠二抗購自abcam。甲唑藍（MTT）購自Sigma；M-MLV逆轉錄試劑盒購自 Promega；2×SYBR real-time PCR試劑盒購自Roche公司；BCA蛋白定量試劑盒，ECL發光檢測試劑盒購自Pierce。

1.3 姜黃素培養細胞細胞以1×106／ml的濃度接種到6孔板，孔內放2ml DMEM（10%小牛血清），培養24h。換新鮮培養液，其中含有溶解的不同濃度姜黃素。繼續培養48h，分別用real-time PCR和 western blot檢測 NF－κB、Bcl-2、p53、磷酸化c－jun，用MTT檢測細胞增殖。抑制腫瘤的生長率＝（無藥對照孔OD值－用藥孔OD值）／無藥對照孔OD值×100%。未添加姜黃素的細胞作為對照。

1.4 QPCR收集細胞，用試劑盒提取總RNA，MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板按照試劑盒操作說明進行real-time PCR，每個反應體系中均加入GAPDH的一對引物作為PCR擴增的內參，反應條件：95℃30s-56℃60s-72℃60s，35個循環。用 Beacon designer 7根據Genbank序列設計引物，經過Blast驗證，上海生工引物合成和基因測序。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測收集PC-3M／CDDP細胞，按照試劑盒說明，用真核細胞裂解液裂解，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量。用12%SDS-PAGE凝膠進行電泳，凝膠通過濕轉裝置將蛋白轉移至NC膜后，將膜置于封閉液（含10% 脫脂奶粉的PBST）中，于搖床搖勻1h。用TBST清洗三次，每次5min，棄清洗液。稀釋一抗（1∶1000）于封閉液中。將膜置于一抗液中，室溫搖床1h。用TBST清洗三次，每次5 min，棄去清洗液。稀釋 HRP標記二抗（1：500）于封閉液。將膜置于上述液中室溫搖床1h。用TBST清洗3次，每次5 min，棄去清洗液。ECL試劑盒顯色，X膠片定影。采用GAPDH蛋白內參。

1.6 統計學數據處理數據用±S表示，采用SPSS12.0統計分析軟件進行分析。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

未姜黃素處理細胞的 NF－κB、磷酸化c－jun和bcl-2蛋白質水平比較高，p53蛋白水平低，說明細胞凋亡水平低，而NF-κB信號通路、JNK信號通路活性高。P-gp是mdr1基因表達的蛋白質，其水平高，說明存在較高的細胞多耐藥。姜黃素作用后，NF-κB、磷酸c-jun、bcl-2蛋白水平顯著下降，說明NF－κB、JNK信號通路明顯受到抑制。此外，p53蛋白水平顯著升高，說明細胞凋亡增加。P-gp水平顯著降低，則細胞多耐藥性顯著減小。相應的灰度值見表2。

表2 各分子相對GAPDH的blot灰度值（48h，%）

LNCaP細胞48h生長率約為92%。不同濃度姜黃素作用后，細胞48h生長率顯著下降，分別是變成30%、17%、3%。

3 討論

腫瘤MDR能夠抵抗臨床藥物的抗腫瘤作用，并且阻抑MDR腫瘤凋亡。本研究中，姜黃素作用于雄性激素依賴性前列腺癌 MDR細胞以后，NF-κB信號通路降低，mdr1／P-gp表達水平下降，bcl-2表達減少，c-Jun磷酸化減弱，而p53表達水平卻顯著升高，MDR細胞的凋亡顯著升高、MDR則顯著下降。相應的，細胞生長也受到顯著抑制。

前列腺癌細胞耐凋亡與NF-κB信號通路相關聯。本研究中，雄性激素依賴性前列腺癌MDR細胞經過姜黃素的作用，NF-κB信號通路受到顯著抑制，級聯反應導致磷酸c－jun水平顯著下降，抑制JNK信號通路。NF-κB信號減低也造成了mdr1／P-gp表達的顯著降低［7］，腫瘤 MDR逆轉成為藥物敏感。

細胞凋亡過程復雜，包括多個基因的調控［11］。前列腺癌細胞表達p53、bcl-2和c-jun，其中p53上調指示細胞凋亡啟動，并且p53對于NF－κB存在相反關聯的效應。NF-κB信號可以通過上調下游bcl-2表達、增強c-jun信號磷酸化激活JNK信號通路，抑制化療藥物誘導型細胞凋亡，最終細胞出現耐藥。在本研究中，姜黃素作用，減低了NF－κB信號，并導致下游bcl-2顯著下調，以及c－jun磷酸化水平減弱。作為相反關聯的凋亡蛋白p53表達則顯著增強，MDR前列腺癌細胞的抗凋亡作用顯著減弱并啟動凋亡進程，然后，細胞生長受到顯著抑制。

總之，本研究結果表明，前列腺癌細胞MDR可能與NF－κB信號介導的抗凋亡作用有關，因此，NF-κB信號可能作為前列腺癌治療的分子靶點。并且，姜黃素作用于MDR前列腺癌細胞，抑制NF－κB信號，下調bcl-2和磷酸化c－jun水平，抑制抗凋亡基因，減小癌細胞MDR，因此，姜黃素有可能治療MDR前列腺癌。

［1］Kolev，Tsonko M.DFT and Experimental Studies of the Structure and Vibrational Spectra of Curcumin［J］.International Journal of Quantum Chemistry.Wiley Periodicals.2005，102（6）：1069.

［2］Srivastava，KC；Bordia A；Verma SK.Curcumin，a major component of the food spice turmeric（Curcuma longa），inhibits aggregation and alters eicosanoid metabolism in human blood platelets［J］.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，1995，52 （4）：223.

［3］韓 婷，宓鶴鳴.姜黃的化學成分及藥理活性研究進展［J］.解放軍藥學學報.2001，17（2）.

［4］Aggarwal，BB.；Shishodia S..Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer［J］.Biochemical Pharmacology.Elsevier.May 2006，71（10）：1397.

［5］Choi，Hyunsung.Curcumin Inhibits Hypoxia-Inducible Factor-1 by Degrading Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator：A Mechanism of Tumor Growth Inhibition［J］.American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics.July 2006，70：1664.

［6］張宇紅，李海民.核轉錄因子κB與腫瘤多藥耐藥的關系［J］.國外醫學外科學分冊2004，31（2）：95.

［7］王 漪，劉 心，張海濤，等.白血病細胞中NF-κB調控 MDR1基因、P糖蛋白及逆轉耐藥的研究［J］.中國實驗血液學雜志，2007，15（5）：950.

［8］于小玲，孫向榮，葉俊麗.器官局限性前列腺癌中 NF-κB和IL-12的表達［J］.濱州醫學院學報.2004，27（4）：319.

［9］趙 川，韓 丹，楊 友，金樹珍.Bcl-2和P53蛋白在前列腺癌組織中的表達及其意義［J］.昆明醫學院學報2006，（4）：72.

［10］潘玉琢，趙燕穎，趙雪儉，李 揚.人前列腺癌多藥耐藥細胞系的建立［J］.吉林大學學報（醫學版）.2007，33（4）：651.

［11］Liang CZ，Zhang JK，Shi Z，Liu B，Shen CQ，Tao HM.Matrine induces caspase-dependent apoptosis in human osteosarcoma cells in vitro and in vivo through the upregulation of Bax and Fas／FasL and downregulation of Bcl-2［J］.Cancer Chemother Pharmacol.2012Feb；69（2）：317.

1007－4287（2012）10－1920－02

2011－08－17）