EPO對糖尿病兔心肌梗死后心肌重塑基質金屬蛋白酶表達的影響

樊國亮，修宗誼，谷天祥，姜德哲，張敏，馬瑞陽

（1.泰達國際心血管病醫(yī)院，天津 300457；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心臟外科，沈陽 110001）

心肌在高血糖狀態(tài)下可發(fā)生纖維化，加之心肌缺血，壞死后纖維化會進一步加劇，進而出現(xiàn)心肌同步運動消失、心室重構、心力衰竭甚至死亡。近年來糖尿病合并冠心病心肌梗死的患者逐年增加，嚴重威脅人類生命和健康，減少缺血壞死區(qū)心肌纖維化是減輕心室重構的重要措施。近年來臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn)，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是心臟保護因子，為能更接近臨床并指導實際工作，我們設計了該實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取40只健康日本大耳兔（中國醫(yī)科大學試驗動物部提供），兔齡5～6個月，體質量2.5～3.0 kg，雌雄不拘，動物合格證號為scxk（遼）2003-0009。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病模型的建立：適應環(huán)境的健康兔，禁食12 h經耳緣靜脈采用2次法注射四氧嘧啶（ALX），按50 mg/kg，間隔1周后再按100 mg/kg注射ALX，注射后即刻50%葡萄糖5 mL灌胃，采用葡萄糖氧化酶法測末次給藥后檢測24和72 h的空腹血糖值，以至少1次空腹血糖≥16.7 mmol/L為建模成功。糖尿病模型建立飼養(yǎng)1個月存活30只，隨機數(shù)字法分為3組：假手術組（A組）、手術對照組（B組）、手術用藥組（C組）。

1.2.2 急性心肌梗死模型建立：禁食12 h，采用速眠新1 mL/kg肌肉注射，10%水合氯醛1 mL/kg腹腔注射麻醉，固定實驗動物于兔臺，連接心電圖，于第Ⅲ、Ⅳ肋間進胸，逐層分離，小開胸器撐開，切開心包，辨別冠脈血管，B、C組暴露前降支，在第一對角支分出后2～3 mm以5-0無創(chuàng)線進針2～3 mm，冠狀動脈結扎成功標志為Ⅱ導聯(lián)心電圖ST段抬高、局部心肌變暗紅、節(jié)段運動不良；A組相應冠狀動脈處穿線不結扎。抽氣關胸，連續(xù)3 d肌肉注射青霉素80萬U/d。

1.3 給藥

C組AMI術后即刻給藥將EPO（上海麒麟鯤鵬生物藥業(yè)提供）按1 000 U/kg，隔1周再給予相同劑量。A、B組注射相應劑量生理鹽水。

1.4 標本采集及觀察指標

C組注射EPO后2周，A、B組術后2周采靜脈血行血常規(guī)檢查血紅蛋白含量。1個月后全麻后迅速取心臟，TTC染色，甲醛固定石蠟包埋，Masson染色、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、組織型基質金屬蛋白酶抑制劑1（tissue inhibitor of metallo proteinase-1，Timp-1）免疫組化染色光鏡下圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，多組比較采用方差分析，2組比較用t檢驗。數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

A組存活8只，B組存活9只，C組存活9只。TTC染色中可見C組心肌梗死面積較B組顯著較少差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；光鏡下半定量數(shù)據(jù)分析，Masson染色及MMP-9免疫組化染色，C組較B組膠原纖維顯著較少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Timp-1免疫組化染色，B組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 膠原纖維、MM P-9、Timp-1表達的比較（±s）Tab.1 The com parison of col lagen fiber，M MP-9 and Timp-1（±s）

表1 膠原纖維、MM P-9、Timp-1表達的比較（±s）Tab.1 The com parison of col lagen fiber，M MP-9 and Timp-1（±s）

1）P<0.05，2）P>0.05 vs group A.

Group Masson MMP-9 Timp-1 Group A 1.82±0.24 10.81±0.25 10.57±0.19 Group B 10.98±0.401） 25.84±0.381） 23.14±0.281）Group C 7.19±1.051） 21.59±0.651） 22.80±0.542）

3 討論

心肌間質的主要成份是膠原蛋白，其作用是維持心肌細胞的排列、協(xié)調心肌收縮性和保持左室?guī)缀涡螤睢嶒炞C實，高血糖狀態(tài)下可出現(xiàn)心肌細胞、基質、微血管發(fā)生顯著變化致使心肌重構。同樣當心肌細胞在缺血缺氧梗死時，就會不僅表現(xiàn)心肌細胞的凋亡、壞死、肥大、延長和心室肌肥厚，還表現(xiàn)為間質纖維膠原合成和降解之間的動態(tài)平衡破壞，導致間質成分組成和量的改變，從而出現(xiàn)心室重塑進一步加劇，最終出現(xiàn)嚴重心力衰竭，甚至死亡。

本試驗采用MMP-9作為觀察指標，主要是因為MMP是一類分解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分的鋅蛋白酶，以酶原形式分泌，可由蛋白酶和多種因子激活主要功能是降解除多糖外的全部細胞外基質組分，并激活其他MMP，形成瀑布效應，是調節(jié)ECM動態(tài)平衡的最重要酶系［1］。按其作用的底物不同可分為膠原酶、明膠酶、基質溶解素及膜型 MMP（membrane type MMP，MT-MMP）。研究證實在心肌梗死后重構期間，心臟 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9 的活性和表達都有增加［2］，Shimizu等［3］發(fā)現(xiàn)在大鼠心肌梗死后，左室非心肌梗死區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原MMP-9的mRNA較對照組明顯升高。Wei等［4］研究發(fā)現(xiàn)大鼠心肌梗死后左室膠原持續(xù)升高至第10周，MMP-9又稱明膠酶B，有著重要的生物學作用，與冠狀動脈和血管重建的關系最為密切［2］，所以選擇MMP-9作為研究對象。MMP-9的作用對象是ECM，ECM是血管和心肌間質的主要成分，在糖尿病冠心病及糖尿病腎病纖維化發(fā)病機制中有重要作用［3］。MMP可以導致ECM合成和降解的平衡被打破。Timps是組織中MMP的天然特異抑制物，MMP和TIMPs之間的動態(tài)平衡是保持ECM穩(wěn)態(tài)的重要條件［4］，目前發(fā)現(xiàn)的TIMPs有4種，Timp-1、Timp-2、Timp-3 及 Timp-4。在心臟中研究較多的是Timp-1，它既可以和活化的MMP以1∶1非共價鍵結合，又可以與MMP酶原結合并阻止其活化，其中Timp-1隨MMP-9表達增高而表達，通過抑制酶原而抑制MMP-9。當兩者比例失衡時就會引起正常膠原結構遭到破壞，使缺乏交連結構的不正常膠原纖維增生沉積，引起膠原重構。本實驗觀察發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌梗死后B、C 2組出現(xiàn)心肌細胞大量壞死，變性，心肌間質中大量膠原纖維滲出，心室肌出現(xiàn)重塑，心室順應性明顯下降。實驗表明，MMP-9在心肌梗死早期即開始激活，且在心肌梗死后心室重構期間MMP-9活性和表達均顯著增高，從而降解ECM，解離整聯(lián)蛋白，產生修復性的纖維化［5，6］。臨床研究表明，在AMI最初數(shù)天，較高的MMP-9與心肌梗死后的左室容積增加有關［7］。Kelly等［8］研究發(fā)現(xiàn)，AMI早期較高水平MMP-9表達可引起在心肌梗死后在數(shù)周和數(shù)月可能出現(xiàn)較廣泛的左室重構。采用MMP-9基因缺失小鼠的研究亦發(fā)現(xiàn)，MMP-9基因缺失小鼠左室擴張及膠原聚積較對照組均明顯減少，這些變化發(fā)現(xiàn)與基因缺失小鼠巨噬細胞浸潤減少有關。以上研究表明，AMI后MMP-9表達及活性提高，直接降解ECM，引起ECM退化，進而導致心肌細胞排列紊亂，從而引起心室的重構，最終導致心力衰竭。

本實驗結果表明心肌梗死后MMP-9活性增加，膠原纖維含量增加，是心肌梗死后心室重構的重要原因，而在EPO干預組在Masson染色下可見纖維增生顯著減輕（P<0.05），在免疫組化染色中MMP-9表達顯著變少（P<0.05），而Timp-1表達變化不顯著（P>0.05），考慮EPO改善心肌纖維化、減輕心肌重塑作用是通過抑制MMP-9的表達及活化引起的，而不是通過增加其抑制蛋白Timp-1的產生起作用。通過分子生物學研究發(fā)現(xiàn)MMP-9 C-末端有血紅素結合蛋白樣區(qū)和鉸鏈區(qū)，因此推測EPO可能是通過自身結構抑制MMP-9活化而起作用，減輕間質的纖維化。EPO對糖尿病兔AMI后有顯著心臟保護作用，心肌間質重塑明顯減輕，該作用可能與EPO抑制MMP-9的產生有關，如何引起MMP-9減輕的機制有待進一步臨床和試驗研究。

［1］Malemud CJ.Matrix metalloproteinases （MMPS）in health and disease：an overview［J］.Front Biosci，2006，11（5）：1696-1701.

［2］Wilson EM，Moainie SL，Baskin JM，et al.Region-and type specific induction of matrix metallopoteinases in post-myocardial infarction remodeling［J］.Circulation，2003，107（22）：2857-2863.

［3］Shimizu N，Yoshiyama M，Takeuchi K，et al.Doppler echocardiographic assessment and cardiac gene expression analysis of the left ventricle in myocardial infracted rats ［J］.Jpn Circ，1998，62（6）：436-442.

［4］Wei S，Chow LT，Shum IO，et al.Left and right ventricular collagen type I/III ratios and remodeling post-myocardial infarction ［J］.Card Fail，1995，5（2）：117-126.

［5］Higo S，Uematsu M，Yamagish M，et al.Elevation of plasma matrix metallopmteihasp-9 in the culprit coronary artery in patients with acute myocardial infarction：clinical evidence from distal protection［J］.Cire J，2005，69（10）：180-185.

［6］王琦，柳兢，姚風臣.替米沙坦對心肌梗死大鼠心肌重構基質金屬蛋酶表達水平的影響［J］.山西醫(yī)藥雜志，2007，36（5）：406-4109.

［7］Webb CS，Bonnema DD，Ahmed SH，et al.Specific temporal profile of matrix metalloproteinase release ocurs in patients after myocardial infarction：relation to left ventricular remodeling ［J］.Circulation，2006，114（10）：1020-1027.

［8］Kelly D，Cockerill G，Ng U，et a1.Plasma matrix metalloproteinase-9 and left ventricular remodeling after acute myocardial infarction in man：a prospective cohort study［J］.Eur Heart J，2007，28（6）：711-718.