青枯菌Po82菌株Ⅲ型分泌系統調控基因hrpB的功能研究

劉 蕾， 徐 進， 許景升， 陳匡宇， 張麗勍， 張 昊， 馮 潔

（中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

青枯菌Po82菌株Ⅲ型分泌系統調控基因hrpB的功能研究

劉 蕾， 徐 進， 許景升， 陳匡宇， 張麗勍， 張 昊， 馮 潔＊

（中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

本文以青枯菌致病力分化菌株Po82的Ⅲ型分泌系統調控基因hrpB為研究對象，采用同源重組雙交換法，構建獲得青枯菌Po82菌株的hrpB基因缺失突變株Po82ΔhrpB及其互補菌株Po82ΔhrpB－pML123－hrpB，并對野生型菌株、突變株和互補菌株進行了致病力及生物學功能的驗證。致病力測定結果表明，青枯菌hrpB基因缺失突變株Po82ΔhrpB的致病力較Po82野生型菌株顯著下降，而互補菌株Po82ΔhrpB－pML123－hrpB能夠部分恢復突變菌株的致病力。生長曲線測定結果表明，在營養貧瘠型培養基中，hrpB基因缺失突變株Po82ΔhrpB的生長速率較野生型青枯菌Po82菌株快，但是在營養豐富型培養基中，兩者生長速率基本一致。野生型和突變株的運動性測定結果顯示，兩者的運動性無顯著差異。表明hrpB基因在青枯菌致病過程中具有重要影響，并對進一步發掘鑒定Po82菌株中新的Ⅲ型效應子，進而深入解析其致病力分化的分子機理具有重要的作用。

青枯菌； Ⅲ型分泌系統；hrpB基因； 致病性

茄科雷爾氏菌［Ralstoniasolanacearum（Smith） Yabuuchi et al.］，簡稱青枯菌，是一種地域分布廣且寄主范圍非常大的毀滅性植物病原細菌［1］。進入寄主植物根部后，青枯菌侵入木質部導管，隨后通過維管束系統快速擴展至植物的地上部分。青枯病典型的快速萎蔫癥狀是由病原菌在維管束中產生大量胞外多糖從而阻塞水分運輸所致。青枯菌作為研究寄主植物與病原細菌分子互作的模式系統之一，目前通過分子遺傳學的研究手段已經鑒定出了多個與致病相關的基因［2－3］。與其他革蘭氏陰性菌相同，Ⅲ型分泌系統（typeⅢsecretion system，T3SS）在青枯菌致病過程中起重要作用。Ⅲ型分泌系統通過高度保守的裝置將蛋白分泌至細胞外，并且通過可變的胞外裝置將效應子蛋白輸送至植物細胞內，干擾宿主細胞信號轉導通路，為病原菌在細胞內存活創造有利條件［4－5］。試驗證明，Ⅲ型分泌系統缺失突變株無法引起寄主的病害特征［6－7］。

青枯菌菌體細胞與植物細胞物理接觸后，感知來自寄主植物的信號，繼而啟動復雜的調控網絡系統控制Ⅲ型分泌系統及其效應子編碼基因的表達。近年來，針對植物信號所調控的hrp（hypersensitive response and pathogenicity）基因簇的研究［8－9］明確了細菌的胞外受體蛋白PrhA（plant regulator of hrp gene）接收植物細胞信號，并將信號依次轉導并激活調控基因prhJ、prhJ和hrpG基因的表達，并最終調控hrpB基因的表達。其中，PrhA、PrhJ、HrpG是植物信號的中間遞體，信號的最終受體是hrpB基因［10］。在基礎培養基（minimal medium）中或者與植物細胞共培養，hrp基因簇的表達依賴于轉錄 激 活 因 子 HrpB［9，11］。HrpB 調 控 因 子 屬 于AraC家族，位于青枯菌調控網絡的最下游。它不僅激發hrp基因簇中各轉錄單元及其上游popABC操縱子的表達，同時還調控了其他多個基因的表達，其中包括許多依賴T3SS分泌系統釋放的效應蛋白。作為調控因子，HrpB的作用原理是通過與Ⅲ型分泌系統裝置蛋白及效應蛋白編碼基因上游的hrpII框（TTCGN16TTCG）順式作用元件結合，從而啟動這些基因的表達［6］。近年來，對于hrpB突變株的轉錄組學分析表明，HrpB調控因子不僅控制Ⅲ型分泌系統組成基因以及超過60種的效應子基因的表達，而且控制依賴于Ⅲ分泌系統輸出途徑相關基因的表達［5］。因此，調控因子HrpB參與青枯菌侵染植物過程，并且對青枯菌的致病性有重要影響。

茄科雷爾氏菌是一個高度復雜的種群。2009年，本實驗室依照國際新近提出的演化型分類框架對保存的286株青枯菌進行了遺傳多樣性的研究［12－13］。并從中發現一株編號為Po82的菌株，該菌株的演化型分類歸屬為演化型Ⅱ／序列變種4，不僅可以對番茄、馬鈴薯、茄子等茄科植物致病，而且同時又對香蕉致病。Po82菌株具有NPB菌株（no pathogenic to banana）和傳統香蕉菌株的致病特征，因此，Po82菌株是一株珍貴的致病力分化菌株［14－15］。

本試驗以青枯菌致病力分化菌株Po82為研究對象，采用同源重組雙交換的方法，使用慶大霉素抗性基因對Ⅲ型分泌系統調控基因hrpB進行了替換。獲得了青枯菌菌株Po82的hrpB基因突變株，命名為Po82ΔhrpB。通過致病力測定以及相關生物學研究，明確了Po82ΔhrpB的生物學特性，為進一步研究青枯菌株Po82的Ⅲ型分泌系統及發掘新的Ⅲ型效應子奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、質粒及培養條件

本研究所使用的菌株、質粒特征及來源見表1。青枯菌株Po82采用NA培養基，28℃條件下培養24～48h。大腸桿菌DH5α采用LB培養基，37℃培養12～16h。

表1 試驗中所使用的菌株和質粒的來源及特征

1.1.2 培養基

突變株篩選培養基為NA培養基附加蔗糖貯存液至終濃度10%。抗生素使用終濃度為：氨芐青霉素（Amp）：100μg／mL；卡那霉素（Kan）：50μg／mL；慶大

霉素（Gm）：50μg／mL。基礎培養基（minimal medium）：Boucher培養基［18］中加入谷氨酸至終濃度20 mmol／L；半固體培養基（SMM）：葡萄糖100mg，蛋白胨100mg，乙二胺四乙酸二鈉38mg，pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液10mL，瓊脂3.5g，用蒸餾水定容到1 000mL，不調酸度，121℃15min滅菌。

1.1.3 主要試劑

Taq酶，dNTP，GC bufferⅠ／Ⅱ，限制性內切酶，T4DNA連接酶，T－載體等均購自大連寶生物（TaKaRa）公司；DNA ladder，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，質粒小提試劑盒，細菌基因組DNA提取試劑盒等均購自北京天根生物工程公司；氨芐青霉素（Amp），卡那霉素（Kan），慶大霉素（Gm），IPTG，X－gal為Sigma公司產品；引物和測序均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；其余試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 青枯菌Po82菌株hrpB基因缺失突變株的構建

青枯菌菌株Po82基因組DNA的提取步驟參見北京天根生物工程公司說明書。突變菌株構建采用同源置換法，以慶大霉素抗性基因作為突變體篩選的抗性基因。將hrpB基因上游（UP）和下游（DOWN）各500bp左右片段，以及慶大霉素抗性基因 （gm），按 照 UP－gm－DOWN 的 順 序 構 建 至pk18mobsacB載體中，進行重組自殺質粒的構建。根據NCBI中已發表的Po82的全基因組序列，分別提取hrpB基因上下游各500bp左右的序列，并設計 PCR 擴 增 引 物：HrpB－UP（forward）：CCG GAATTC CGCGGCGATCAGAACACG（下劃線部分為EcoR I酶切位點）；HrpB－UP（reverse）：CGC GGATCC GGCAATGCTC CTGAAGC（下劃線部分為BamH I酶切位點）；HrpB－DOWN（forward）：TGC TCTAGA GCCTCTCCAGCGGACCG（下劃線部分為XbaI酶切位點）；HrpB－DOWN（reverse）：CCC AAGCTT AGGTCGCGCA CCAGCTCGACC（下劃線部分為HindⅢ酶切位點）。慶大霉素抗性基因：GMF：CGC GGATCC GGACGCACACCGTGGAAA（下劃線部 分 為BamH I酶 切 位 點）；GM－R：TGC TCTAGA GGCGGCGTTGTGACAATTT（下劃線部分為XbaI酶切位點）。PCR擴增條件：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30個循環；72℃7min。構建好的重組自殺質粒（pk18－hr－pB－gm）交由上海生工進行序列測定。

青枯菌感受態細胞的制備以及電擊轉化參照Ausubel等［19］以及 Laiva［20］等方法。將構建好的重組自殺質粒pk18－hrpB－gm電擊導入青枯菌Po82菌株中，經過3次篩選［21］及PCR驗證，最終獲得抗慶大霉素和蔗糖，并且對卡那霉素敏感的hrpB基因突變株Po82ΔhrpB。

挑取對卡那霉素敏感的菌落進行PCR擴增驗證。PCR 引 物：HrpB－UP （forward）／ HrpBDOWN（reverse），以及根據hrpB基因ORF中間序列設計引物：BORF－F：ATCCGCCATTCGGATGACC；BORF－R：ACGACTTCCACCTTGGTCTG。PCR擴增條件：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，共30個循環；72℃7min。

1.2.2 互補菌株的構建

根據已發表的hrpB基因序列，設計PCR引物，擴增hrpB基因的ORF序列，經酶切連接至互補載體pML123中。hrpB基因引物序列為，BF：GC GGATCC ATGCTGGGAAACATCTACTTCG（下劃線部分為BamH I酶切位點）；BR：CCC AAGCTT TCAGCGCCAG ATGGTTTCGG AGG（下劃線部分為HindⅢ酶切位點）。根據載體pML123序列設計引物PR：AGCCGAATAGCCTCTCCACCC，與BF進行PCR驗證。PCR擴增條件：變性94℃5min；30個循環（94℃30s，58℃30s，72℃1min）；延伸72℃7min。構建好的互補載體（pML123－hrpB）交由上海生工進行序列測定。

制備青枯菌Po82菌株電擊感受態，將構建好的重組表達載體pML123－hrpB電擊導入青枯菌Po82ΔhrpB菌株中，在含有卡那霉素和慶大霉素的平板上進行篩選，最終獲得具有抗性的互補菌株Po82ΔhrpB－pML123－hrpB。

1.2.3 野生型、突變菌株以及互補菌株致病力測定

參照He等［22］傷根接種法，接種番茄感病品種‘中蔬5號’。野生型、突變株以及互補菌株各接種10株，重復3次。接種后的番茄植株置于光照培養箱中進行培養，培養條件為：16h光周期，（32±1）℃／（28±1）℃，相對濕度90%。每天調查發病情況，持續觀察2～3周，記錄病情指數。青枯病的病情分級及調查方法參照 Meng等［23］的方法。用SAS統計軟件中LSD（p＝0.05）進行數據分析。

1.2.4 突變菌株以及野生型菌株生長曲線的測定

挑取Po82野生型及hrpB基因突變株Po82ΔhrpB單菌落于NA液體培養基中過夜培養，離心收集菌體。生長曲線的測定參照 Kanda等［24］方法：（1）以基礎液體培養基懸浮菌體，調節A600至相同大?。s為0.005），28℃，200r／min振蕩培養，間隔6h測量A600的值，試驗共重復3次。（2）以NA液體培養基懸浮菌體，調節A600至相同大小（約為0.005），28℃，200r／min振蕩培養，間隔6h測量A600的值，試驗共重復3次。

1.2.5 突變菌株以及野生型菌株運動性檢測

運動性檢測參照Kelman等方法［25］。各取5μL濃度為3×108cfu／mL的野生型和突變株的菌體懸浮液，滴加至半固體SMM平板上，28℃條件下培養3～5d。觀察細菌的運動性情況，并使用直尺進行測量。

2 結果

2.1青枯菌Po82菌株hrpB基因缺失突變株的構建

本試驗中，使用慶大霉素抗性基因作為突變體篩選的抗性基因。將基因上游（UP）和下游（DOWN）各500bp左右片段，以及慶大霉素抗性基因（gm，長度為855bp），按照 UP－gm－DOWN 的順序構建至pk18mobsacB載體中，構建hrpB基因重組自殺質粒（pK18－hrpB－gm）。提取質粒使用限制性內切酶EcoR I和HindⅢ進行酶切以及測序驗證。酶切結果如圖1所示表明，泳道1中有2條帶，分別位于6.0kb左右和1.8kb左右。其中，空載pk18mobsacB 長 度 約 為 5.6kb，片 段 UP－gm－DOWN長度為1.8kb左右。因此，片段 UP－gm－DOWN已成功連接至pk18mobsacB。

圖1 hrpB基因重組自殺質粒的構建

2.2 青枯菌菌株Po82突變株的篩選與鑒定

將hrpB基因重組自殺質粒（pK18－hrpB－gm）電擊轉化至青枯菌菌株Po82中，經3步篩選，獲得hrpB基因突變株Po82ΔhrpB。使用PCR方法，對突變株進行鑒定。分別以野生型菌株Po82的全基因組DNA，hrpB基因重組自殺質粒，以及hrpB基因突變株的全基因組DNA為模板，使用引物為HrpB－UP（forward）／HrpB－DOWN（reverse），以 及hrpB基因部分 ORF序列引物BORF－F／BORF－R。PCR鑒定結果如圖2所示。從PCR結果可以看出，使用 引 物 HrpB－UP（forward）／HrpB－DOWN（reverse）進行PCR擴增，野生型菌株片段長度為2.4kb左右（圖2，泳道3基因上游及下游序列各500bp，hrpB基因 ORF長度為1.4kb），hrpB基因重組自殺質粒和hrpB基因突變株擴增片段為1.8kb（圖2，泳道1，2）；使用引物BORF－F／BORFR進行擴增，野生型菌株擴增出約為600bp的片段（圖2，泳道6），而重組自殺質粒（圖2，泳道5）和hrpB基因突變株未能擴增出片段（圖2，泳道4）。

圖2 hrpB基因突變株篩選結果

2.3 互補菌株的構建與鑒定

根據青枯菌Po82菌株hrpB基因的ORF序列設計引物，并連接至互補載體pML123中，構建載體pML123－hrpB。使用引物BF／PR進行PCR驗證，PCR擴增所獲得的片段長度約為1.6kb。結果表明，hrpB基因已成功連接至載體pML123中。隨后，將載體pML123－hrpB電轉化轉入突變株Po82△hrpB中，于含有慶大霉素和卡那霉素的NA平板篩選轉化子。用引物BF／PR進行PCR和測序驗證，最后，將得到的互補菌株命名為Po82ΔhrpB－pML123－hrpB（圖3）。

圖3互補菌株篩選結果

2.4 致病力測定

傷根澆注菌液接種法接種番茄進行致病力測定，統計結果表明，Po82野生型菌株接種后的番茄植株，于第5天開始發病，而突變株接種后植株則在第6天開始表現出明顯萎蔫癥狀；接種后10d，接種野生型菌株植株的病情指數已高達3.73，而hrpB基因突變株Po82ΔhrpB僅為1.63，較野生型菌株降低了56.3%，SAS方差分析結果表明兩者差異達極顯著水平（圖4、圖5）。與野生型菌株相比，互補菌株Po82ΔhrpB－pML123－hrpB能夠部分恢復突變菌株的致病力。

圖4 野生型、突變株和互補株接種番茄第10天發病情況

2.5 生長曲線的測定

分別對青枯菌Po82野生型菌株和hrpB基因突變株Po82ΔhrpB在營養豐富型培養基（NA液體培養基）和營養貧瘠型培養基（Boucher基礎培養基）中的生長曲線進行了測定。圖6結果表明，青枯菌Po82野生型菌株和突變株Po82ΔhrpB在營養豐富型培養基中生長速率無明顯差異；方差分析結果表明，在營養貧瘠型培養基中培養18h后，兩者生長速率開始表現出明顯差異（p＜0.05），Po82ΔhrpB比野生型菌株生長速率要快。（圖7）。

2.6 運動性測定

使用半固體培養基，研究青枯菌株Po82野生型菌株和hrpB基因突變株Po82ΔhrpB運動性。通過測量菌落直徑，青枯菌株Po82野生型菌株和hrpB基因突變株Po82ΔhrpB的運動能力沒有差異（圖8）。結果表明，hrpB基因的突變對青枯菌Po82菌株的運動性沒有影響。

圖8 野生型菌株Po82與hrpB基因突變

3 結論與討論

作為世界范圍內最為重要的細菌病害之一，青枯病受到了各國植物病理學家的廣泛關注。近年來隨著全球經濟一體化進程的加快，外來有害生物入侵日益成為各國關注的熱點。其中，作為有害外來生物，香蕉細菌性枯萎病（茄雷爾氏菌2號小種）的高風險入侵途徑主要為帶菌植物材料，并且該病菌在我國屬于具有潛在入侵風險的危險性外來有害生物，被列為我國的檢疫對象［26］。本實驗室保存的青枯菌Po82菌株由于其寄主范圍的特殊性，本研究將其列為研究對象，對于深入解析青枯菌致病力進化的分子機理具有重要意義。

T3SS作為植物病原細菌分泌毒力因子的重要裝置，已成為植物病理學界的研究熱點之一［27］。hrpB起著轉錄激活因子的作用，不僅激發本基因簇中各轉錄單元及popABC操縱子的表達，同時調控了菌體中其他基因的表達，其中許多為依賴T3SS分泌系統釋放的效應蛋白。近年來，針對hrpB基因的研究已于多個青枯菌株中展開。Vasse等［28］對青枯菌1號小種菌株GMI1000中的hrpB基因功能進行研究，結果表明，hrpB突變株在番茄根部維管束系統中的侵染、定殖和擴展能力都有所減弱。Kanda等［24］對煙草青枯菌OE1－1的hrpB基因進行突變，獲得與之類似的結果。本試驗利用同源基因置換法構建了青枯菌致病力分化菌株Po82的hrpB基因突變株Po82ΔhrpB，并對該突變株的致病力及生物學特性進行了分析。研究結果表明，hrpB基因突變株Po82ΔhrpB相對于野生型菌株Po82，致病力明顯下降，而互補菌株Po82ΔhrpB－pML123－hrpB能夠部分恢復突變株菌株的致病力。綜上所述，hrpB基因對于青枯菌Po82菌株的致病性起關鍵作用。

Kanda等［24］對煙草青枯菌 OE1－1的生長曲線進行了測定，結果表明，無論是在營養豐富型培養基和營養貧瘠型培養基中，野生型菌株OE1－1與hrpB基因突變株的生長速率均保持一致。本試驗對青枯菌Po82菌株的生長曲線進行研究，結果表明，在營養豐富型培養基中，野生型青枯菌Po82菌株的生長速率與hrpB基因突變株Po82ΔhrpB基本一致；而在營養貧瘠型培養基中，hrpB基因突變株Po82ΔhrpB的生長速率比野生型青枯菌Po82菌株快，這與Kanda等［24］研究結果不一致，而出現這種生長速率的差異尚未見報道，目前，還不清楚hrpB基因突變后青枯菌Po82菌株的代謝是否發生變化，因此，需進行下一步試驗來探究其出現差異的原因。

在自然條件下，青枯菌的侵染過程包括識別、吸附、侵入、定殖、擴展和顯癥等步驟。傷根澆注菌液的接種方法包括以上全部過程被認為最接近于青枯菌自然發病情況；而莖部注射接種方法缺少識別、吸附、侵入過程，僅存在病原菌侵入以后的定殖、擴張及顯癥步驟。因此，運動性在青枯菌侵染初期具有重要的作用，而對于青枯菌侵入植物以后的致病過程不起作用。Vasse等［28］研究結果表明，青枯菌GMI1000菌株hrpB基因缺失突變株在侵染植物過程中的侵入、定殖和擴展的能力有所下降，而識別和吸附的過程與野生型沒有差異。本試驗對于野生型菌株和突變菌株的運動性試驗表明，hrpB基因對青枯菌Po82菌株的運動性沒有影響，與上述結論相一致。

hrpB基因不僅激發hrp基因簇中參與形成Ⅲ型分泌系統裝置蛋白編碼基因的表達，同時正調控依賴T3SS分泌系統泌出的效應蛋白，因此，在鑒定新的Ⅲ型效應子過程中，hrpB基因突變株的構建是至關重要的步驟。Cunnac等［29］在構建了青枯菌GMI1000菌株的hrpB基因突變株的基礎上，鑒定出了48個新的依賴于hrpB基因的Ⅲ型效應子。因此，青枯菌Po82菌株hrpB基因缺失突變株的構建及其相關生物學功能的分析對進一步發掘鑒定Po82菌株中新的Ⅲ型效應子，進而深入解析其致病力進化的分子機理具有重要的作用。

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The role of typeⅢsecretion system regulatorhrpBgene inRalstoniasolanacearumstrain Po82

Liu Lei， Xu Jin， Xu Jingsheng， Chen Kuangyu， Zhang Liqing， Zhang Hao， Feng Jie
（StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseaseandInsectPests，InstituteofPlantProtection，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China）

Ralstoniasolanacearumstrain Po82，apathogenic variation strain，possesses pathogenic traits of both NPB andMokostrains.hrpBgene encodes a positive regulator and controls the expression of the typeⅢsecretion system （T3SS）and pathogenicity effectors transiting through this pathway.The mutant ofhrpBgene was constructed by using homologous recombination，and named Po82ΔhrpB.Based on the mutant strain，the complement strain was also constructed.The pathogenicity and the biological function of the wild type，the mutant strain and the complement strain were tested.Pathogenicity test showed that disease index of the mutant Po82ΔhrpBwas decreased compared with that of the wild type Po82.Growth curve analysis indicated that Po82ΔhrpBmutant grew as fast as the Po82strain in rich medium，whereas，in Boucher’s minimal medium，Po82ΔhrpBmutant grew faster than the Po82.There were no significant differences between the mutants and wild type strain in the ability of mobility.ThehrpBgene was a critical factor in pathogenicity ofR.solanacearumand played an important role in identifying new typeⅢeffectors and analyzing the molecular mechanism of pathogenicity variation.

Ralstoniasolanacearum； typeⅢsecretion system；hrpBgene； pathogenicity

Q 753

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.002

2011－12－14

2012－01－18

國家重點基礎研究發展計劃（“973”）項目（2009CB119200）；國家高技術研究與發展計劃（“863”）項目（2012AA101501）；國家自然科學基金（31101409，31272008）

＊ 通信作者E－mail：jfeng＠ippcaas.cn