甘肅省馬鈴薯壞疽病病原鑒定

文朝慧， 何蘇琴， 荊卓瓊

（1.甘肅省出入境檢驗檢疫局，蘭州 730020；2.甘肅省農業科學院植物保護研究所，蘭州 730070）

甘肅省馬鈴薯壞疽病病原鑒定

文朝慧1， 何蘇琴2＊， 荊卓瓊2

（1.甘肅省出入境檢驗檢疫局，蘭州 730020；2.甘肅省農業科學院植物保護研究所，蘭州 730070）

本文通過Koch’s法則以及形態學和分子生物學方法對甘肅省蘭州市馬鈴薯壞疽病進行病原鑒定。從馬鈴薯壞疽病標樣中分離得到5株形態特征一致的產生分生孢子器的腔孢綱真菌，其代表菌株GSAA－0232對馬鈴薯塊莖具有強的致病性，用該菌接種馬鈴薯塊莖，可引起與自然發病相同的壞疽病癥狀。該菌的培養物生成代謝物“E”（NaOH斑反應顯示出特有的紫紅色）。利用引物Phoma－2／Phoma－7可擴增出474bp的Phomafoveata特異條帶。根據其形態特征、生物學特性、致病性及分子生物學鑒定結果 （GenBank登錄號：JQ963624），將菌株GSAA－0232鑒定為Boeremiafoveata（Foister）Aveskamp，Gruyter ＆Verkley。這是Boeremiafoveata引起馬鈴薯壞疽病在我國的首次報道。

馬鈴薯； 壞疽病；Boeremiafoveata；Phomafoveata

隨著產業結構的調整，馬鈴薯已成為甘肅省重要的經濟作物，種植面積和總產量在國內都名列前

茅［1］，2011年全省馬鈴薯播種面積達700 000hm2［2］。隨著馬鈴薯集約化程度的提高，馬鈴薯貯藏期腐爛問題也日漸突出［3－4］。

2002、2009年，作者在蘭州市榆中、皋蘭出產的馬鈴薯薯塊中發現了壞疽病病薯，并對病原菌進行了分離和鑒定，現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 培養基及配方

PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖15g，瓊脂粉12g，自來水1 000mL。

OA：燕麥片20g，瓊脂粉12g，自來水1 000mL。

MEA：麥芽浸粉40g，瓊脂粉12g，自來水1 000mL。

1.2 病害癥狀描述

根據自然感病和人工接種發病薯塊進行癥狀描述。

1.3 標樣采集和病原分離

病薯標樣采集自蘭州榆中和皋蘭菜農自產自銷的商品薯，取病健交界處病組織做常規分離，挑取尖端菌絲進行純化。

1.4 病菌致病性測定

用直徑0.5cm打孔器在經75%乙醇表面消毒的健康馬鈴薯薯塊上打一深0.5cm小孔，將在PDA平板上20℃培養4d的直徑0.5cm病菌菌絲塊接種于孔中，再將原薯塊組織塞回并用透明膠帶封口，置5℃和15℃培養，不接菌為對照，每處理5個馬鈴薯薯塊。16d后切薯調查發病情況并對發病薯塊進行病原菌再分離。

1.5 病原菌形態特征及生物學特性研究

切取直徑5mm的菌絲圓片移植于PDA平板中央，分別于5、10、15、20、25、30、35℃下恒溫培養，6d后測量菌落直徑，觀察記載病菌培養性狀及形態特征。每處理重復3次；繼續培養至20～40d，觀察測量分生孢子器及器孢子的形態和大小。

取直徑5mm的菌絲圓片移植于OA、MEA平板中央，20℃黑暗培養7d，測量菌落直徑，描述菌落形態；然后將培養皿轉放到13h近紫外燈＋11h黑暗／d，20℃培養，以刺激菌落色素的產生和分生孢子器的生成，7d后再次描述菌落形態，并在菌落邊緣滴加1mol／L NaOH 水溶液，觀察色斑反應［5－6］。

1.6 PCR－RFLP

將待鑒分離物置PDA培養基、20℃、黑暗條件下培養5d，刮取菌落邊緣新鮮菌絲，采用常規CTAB法提取基因組DNA為擴增模板，利用特異引物Phoma－2：5′－GGACCCCTGTACTGACGTC－3′和 Phoma－7：5′－AGC GGCTAGGATAGACAGGCG－3′，擴增病菌基因組DNA中的特異片段［7］。PCR反應體系總體25μL：10×Taqreaction buffer 2.5μL，1.5mmol／L MgCl22μL，dNTPs（2.5mmol／L）1μL，引物（20μmol／L）各0.5μL，Taq（5U／μL）0.2μL，DNA模板1μL，ddH2O補足25μL體積。反應程序為94℃預變性3min；94℃15s，62℃30s，72℃1min，30個循環；72℃延伸10min，4℃保存。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。預期產物經回收、連接轉化和PCR鑒定后，純化質粒送大連寶生物工程有限公司測序。測序結果與NCBI／GenBank數據庫中的已有序列進行BLASTn比對，確定與試驗菌株的相關性。

分別用限制性內切酶DdeⅠ和DpnⅡ酶切PCR反應產物，10μL體系：5μL PCR反應液，0.5μL限制性內切酶溶液，1μL緩沖液，ddH2O補足體積，37℃酶切3h。產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒別PCR反應產物的DdeⅠ和DpnⅡ的酶切圖譜。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

病薯外表可見不規則黑褐色稍凹陷斑塊，切開病薯，薯內形成大的孔洞，腐爛組織呈淡褐色、深紅褐色或深褐色，自然發病的病薯一般自臍點或有傷痕處形成侵染（圖1a～c）。

2.2 病原分離結果

從典型壞疽病癥狀的馬鈴薯病薯上分離得到5株菌落形態一致的褐色、產生分生孢子器的腔孢綱真菌，將其中的代表菌株編號GSAA－0232。

2.3 病菌致病性測定結果

不同溫度條件下病害癥狀及嚴重度不同：15℃下，病斑深紅褐色，在薯內形成大的裂孔，表皮黑褐色，不規則，稍下陷，病斑長16～31mm（平均21.3mm），寬14～25mm（平均18.0mm），深22～29mm（平均25.3mm）；5℃下，病斑淡紅褐色至淡褐色，病組織糟松狀，有時有小的開裂，表皮黑褐色，不規則，稍下陷，病斑長15～19mm（平均17.0mm），寬13～16mm（平均14.7mm），深10～14mm（平均12.0mm）。15℃下薯塊受害較5℃下嚴重。對照未發病。

15℃回接發病的馬鈴薯塊莖表現出與自然病薯相同的癥狀。從回接發病馬鈴薯塊莖中可100%分離得到原接種病菌。

2.4 病原菌菌落形態和生物學特性

GSAA－0232在PDA平板上，20℃培養7d，菌落直徑（69.7±0.5）mm，菌落灰褐色，邊緣白色，菌落背面黃褐色；培養20d，菌落紅褐色，表層的網狀菌絲上散生大量黑色微粒狀分生孢子器，菌落表面散布無色透明微小水珠，菌落背面可見大小不等的黑褐色斑塊。

GSAA－0232在OA平板上，20℃培養7d，菌落直徑（72.2±0.6）mm，菌落黃褐色，邊緣整齊，幾乎沒有氣生菌絲，菌落背面黃褐色；培養14d，菌落深豆沙色，氣生菌絲薄而稀疏，邊緣稍多；培養基內生大量深褐色斑塊，菌落背面與正面色同。

GSAA－0232在MEA平板上，20℃培養7d，菌落直徑（70.7±1.2）mm，菌落淡黃褐色，邊緣整齊，氣生菌絲薄氈狀，菌落背面亮黃褐色；培養14d，菌落黃褐色，氣生菌絲薄氈狀，菌落表面散生暗褐色分生孢子器，菌落背面亮黃褐色，可見黃色粉粒狀結晶。

NaOH斑反應顯示出特有的紫紅色，顯示菌株GSAA－0232生成代謝物“E”（即可擴散的蒽醌色素，在酸性條件下蒽醌色素呈黃色，在堿性條件下呈紅色）［5－6］。

GSAA－0232菌落形態及 NaOH斑反應見圖1d～g。

菌絲的適宜生長溫度為15～20℃；30℃和35℃下菌絲不生長，在30℃和35℃下培養5d后，將培養皿移至20℃，30℃下培養5d的接種體可恢復生長，35℃下培養5d的僅有1／3的接種體可恢復生長（圖2）。

圖1 馬鈴薯壞疽病癥狀、菌落形態及NaOH色斑反應

圖2 溫度對GSAA－0232菌絲生長的影響（PDA平板，培養6d）

GSAA－0232的顯微形態特征：PDA平板20℃培養，菌絲無色至褐色，粗菌絲10.0～12.5μm；中等粗菌絲3.7～8.7μm；細菌絲1.3～2.5μm；分生孢子器壇形，散生或聚生于培養基表面及培養基內，深褐色，常被褐色網狀菌絲包圍，孔口不明顯，直徑89.1～198.0μm，平均139.8μm；高108.9～297.0μm，平均162.5μm；器孢子單孢，無色，壁薄，兩端鈍圓的短柱狀、長橢圓形、香蕉形，甚至不規則形，孢子均勻或一端稍大，直或略彎，（3.0～7.5）μm×（2.0～3.0）μm，平均（5.3×2.4）μm。在 MEA 平板20℃培 養，器 孢 子 大 小 為 （4.0～7.5）μm× （1.2～2.5）μm，平均（5.4×1.8）μm（圖3）。

圖3 GSAA－0232顯微形態特征

2.5 PCR－RFLP結果

引物Phoma－2／Phoma－7在菌株 GSAA－0232中擴增出約474bp的Phomafoveata特異條帶［7］。

測序后經BLAST比對表明，該序列（JQ963624）與Phomafoveata菌株79／139（AF079897.1）、ATCC 24771（AF079896.1）序列同源性為100%。

擴增產物經DdeⅠ酶切后產生256bp和118bp 2個條帶，經DpnⅡ酶切后產生267bp和207bp 2個條帶，與預期片段大小相符（圖4）。

圖4 PCR檢測及酶切圖譜

3 結論與討論

從蘭州馬鈴薯壞疽病病薯中分離得到菌落形態一致的產分生孢子器的腔孢綱真菌，其代表菌株GSAA－0232對馬鈴薯塊莖具有強的致病性，培養物生成代謝物E（NaOH斑反應顯示出特有的紫紅色），利用引物 Phoma－2／Phoma－7可擴增出474bp的Boeremiafoveata（＝Phomafoveata）特異條帶。根據其形態特征、生物學特性、致病性及分子檢測結果，將菌株GSAA－0232鑒定為Boeremiafoveata（Foister）Aveskamp，Gruyter ＆ Verkley。

Boeremia屬是Aveskamp等于2010年建立的新屬［8－9］。Aveskamp 等 采 用 多 位 點 序 列 分 型 法（multilocus sequence type，MLST）對206個分類單元（其中159個分類單元已知與Phoma關系密切）的378個菌株的LSU、SSU、ITS、TUB基因進行了多重分析，依據系統發育分析結果并結合形態學，建立了新屬BoeremiaAveskamp，Gruyter＆Verkley，8個新種，2個新變種，61個新組合。馬鈴薯壞疽病病原被新組合為Boeremiafoveata，該菌隸屬于子囊菌門（Ascomycota），盤菌亞門（Pezizomycotina），座囊菌綱（Dothideomycetes），格孢菌亞綱（Pleosporomycetidae），格孢腔菌目 （Pleosporales），Didymellaceae科，Boeremia屬：

Boeremiafoveata（Foister） Aveskamp，Gruyter＆Verkley 2010［Legitimate；MB515653］

Basionym ：PhomafoveataFoister 1940 ［Legitimate；MB289414］

Obligate synonym（s）：

PhomafoveataFoister 1940 ［Legitimate；MB289414］

Phomaexiguavar.foveata（Foister）Boerema 1967［Legitimate；MB350008］

Phomasolanicolavar.foveata（Foister）Malcolmson 1940［Legitimate；MB494129］

Phomasolanicolaf.foveata（Foister）Malcolmson 1958［Legitimate；MB350016］

Boeremiafoveata（＝Phomafoveata）最早發現于蘇格蘭的馬鈴薯塊莖［10］，之后在秘魯的阿爾蒂普拉諾高原地區的昆諾藜（Chenopodiumquinoa）上發現該菌，并認為南美高原可能是該菌的地理發源地［11］。

Boeremiafoveata引起的壞疽病是馬鈴薯貯藏期的重要病害，也是重要的檢疫性病害，已發生于澳洲、歐洲、北美洲和南美洲，病菌在土壤中可存活多年［12－13］。病菌還可侵染馬鈴薯的莖，病莖較健康莖早衰［14］。

在蘇格蘭，引起馬鈴薯塊莖壞疽病和干腐病的病原中，Boeremiafoveata引發病害的腐爛指數最高，其腐爛指數較Boeremiaexigua（＝Phomaexigua）高出5倍，較Phomaeupyrena高出10倍［15］。在澳大利亞的塔斯馬尼亞，馬鈴薯壞疽病病原中，Boeremiaexiguavar.exigua（＝Phomaexiguavar.exigua）所占比率為90%，Boeremiafoveata所占比率為10%［16］。

Boeremiaexiguavar.exigua是多主寄生真菌，已報道從超過200個屬的植物上分離到該菌，且無寄主專化現象［17］。在我國，梁力哲從辣椒種子上也分離到了該菌［18］。

由于Boeremiafoveata和Boeremiaexiguavar.exigua在形態特征上相似，而一些Boeremia foveata分離物又會喪失產生特征性蒽醌色素的能力［19］，給種類鑒定帶來了困難。隨著現代生物技術的發展，一些分子檢測鑒定技術被用于Boeremia foveata的輔助鑒定［20－21］，其中 Macdonald等的方法具有較好的可重復性。本研究即采用Macdonald等的方法對病菌進行了分子生物學鑒定。

雖然馬鈴薯壞疽病具有較典型的病斑下陷、病健界限明顯等特征性癥狀，但在實際操作中，壞疽病與鐮刀菌引起的干腐病還是很容易混淆［22］。

本研究中，馬鈴薯壞疽病病薯率較低，3批次樣本的病薯率均低于1%。

這是Phomafoveata引起馬鈴薯壞疽病在我國的首次報道。研究菌株保存于甘肅省農業科學院植物保護研究所病害研究室。

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Identification of the pathogen of potato tuber gangrene in Gansu Province

Wen Zhaohui1， He Suqin2， Jing Zhuoqiong2
（1.GansuEntry－ExitInspectionandQuarantineBureau，Lanzhou730020，China；2.InstituteofPlantProtection，GansuAcademyofAgricultural Sciences，Lanzhou730070，China）

The pathogen of potato tuber gangrene in Gansu Province was identified through Koch’s rule and morphological characteristics，and specific fragment DNA sequence by using the specific primers Phoma－2／Phoma－7.Totally 5 strains were isolated from the diseased potato tubers with typical gangrene symptoms in Lanzhou City of Gansu Province in 2002 and 2009，and the pathogenicity was confirmed by Koch’s rule.A474－bp DNA fragment was amplified from the strain GSAA－0232 by using the specific primers Phoma－2／Phoma－7.The fungus produced an yellowish－brown anthraquinone pigment in culture，showing purplish red colour as well as drop of NaOH.Based on morphological characteristics，biological features，pathogenicity and molecular specialities（GenBank accession：JQ963624），the pathogen was identified asBoeremiafoveata（Foister）Aveskamp，Gruyter ＆Verkley.This is the first report of potato gangrene caused byB.foveatain China.

potato； gangrene；Boeremiafoveata；Phomafoveata

S 435.32

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.008

2012－05－01

2012－05－23

＊ 通信作者E－mail：gshesuqin＠sina.com