柑橘黑斑病菌生物學特性研究

盧松茂， 羅金水， 張漢榮， 余智城， 林智明， 林秀香

（福建省熱帶作物科學研究所，漳州 363001）

柑橘黑斑病菌生物學特性研究

盧松茂， 羅金水， 張漢榮， 余智城， 林智明， 林秀香

（福建省熱帶作物科學研究所，漳州 363001）

本文測定了不同培養基、溫度、pH、光照條件對柑橘黑斑病菌柑橘葉點霉（Phyllostictacitricarpa）菌絲生長和孢子萌發的影響，以明確其生物學特性。結果表明，該菌最適生長的培養基為燕麥片瓊脂培養基（OA）；菌絲最適生長溫度為25～30℃，最適pH為5～7；在12h光暗交替條件下生長最好，全黑暗條件下生長最慢。分生孢子萌發最適溫度為25℃，最適pH為6，以在0.2%葡萄糖溶液中的萌發率最高。菌絲和分生孢子在55℃水浴處理10min均失活。

柑橘黑斑病； 柑橘葉點霉； 生物學特性

致 謝： 本研究得到浙江大學農業與生物技術學院李紅葉教授指導與幫助，謹表示衷心的感謝。

聯系方式E－mail：songmaolu＠163.com

柑橘黑斑病（citrus black spot）是柑橘的一種重要病害，又名柑橘黑星病，在歐盟、美國等地是重要的對外檢疫性有害生物。1895年由Benson［1］最早報道了該病害在澳大利亞新南威爾士州柑橘園的危害，現分布于非洲、亞洲、南美洲等許多國家和地區，在中國此病主要分布在廣東、福建、浙江、江西、四川、湖南、湖北及臺灣等地區［2］。該病由柑橘葉點霉［Phyllostictacitricarpa（McAlp.）Van der Aa］引起，有性態為柑果球座菌（GuignardiacitricarpaKiely）［3－4］，能 侵 染 危 害 金 柚［5］、沙 田 柚［6］、琯 溪 蜜柚［7］、蒼南四季柚［8］、檸檬［9］等多種柑橘類植物的果實、葉片和枝梢，典型癥狀為病斑邊緣呈紅褐色或黑褐色，中部稍凹陷，灰色，散生黑色小粒點（分生孢子器），影響果實的外觀和品質。近年來，該病害在全國最大的柚類鮮果生產基地和出口示范基地福建省平和縣［10］琯溪蜜柚種植區發生危害形勢日益嚴峻，果園發病率在10%～15%，嚴重的達30%以上，對柚果出口造成嚴重影響［11］。由于國內外尚未見該病原菌生物學特性系統研究的報道，因此，作者于2010－2011年對該病原菌的生物學特性進行了系統研究，以期為該病害的預測預報及防治提供理論依據。現將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

柑橘葉點霉［Phyllostictacitricarpa（McAlp.）Van der Aa］由浙江大學農業與生物技術學院李紅葉教授提供。用燕麥培養基（OA）在光暗交替（光照12h、黑暗12h）條件下25℃霉菌培養箱培養7d保存備用。

1.1.2 供試培養基［12］

燕麥培養基（OA）：燕麥片30g、瓊脂粉7g、水1L；馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉7g、水1L；PDA＋柚葉汁培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉7g、20g柚葉（磨成汁）、水1L；麥芽膏培養基（MEA）：麥芽膏20g，瓊脂粉7g，水1L；櫻桃汁培養基 （CHA）：櫻桃汁（200mL）、瓊脂粉7g、水1L。將以上培養基分別分裝于三角瓶中，在121℃下滅菌20min后備用。

1.2 方法

1.2.1 培養基對菌絲生長的影響

在PDA、OA、MEA、CHA、PDA＋柚葉汁培養基平板上，分別接種該病原菌菌絲，在25℃培養箱中光暗交替條件下培養，7d后觀察菌落特征并采用十字交叉法測量菌株菌落大小。每個處理重復4次。

1.2.2 不同營養液對分生孢子萌發的影響

分別用0.2%葡萄糖溶液、0.2%α－乳糖溶液、10%柚葉汁和無菌水配制孢子懸浮液，在高倍鏡下每個視野20～30個分生孢子，用移液槍吸取15μL溶液在單凹玻片上，置于25℃培養箱中保濕培養，18h后觀察記錄分生孢子萌發情況。每個處理觀察200個分生孢子，重復3次。

1.2.3 溫度對菌絲生長和分生孢子萌發的影響

在PDA培養基平板上，接種菌株菌絲，分別置于10、15、20、22、25、28、30、35、40 ℃霉菌培養箱中光暗交替培養。7d后觀察菌落特征并采用十字交叉法測量菌落大小。每個處理重復4次。

用pH 6的0.2%葡萄糖溶液配制分生孢子懸浮液，在高倍鏡下每個視野20～30個分生孢子，用移液槍吸取15μL溶液在單凹玻片上，置于15、20、22、25、28、30、35 ℃霉菌培養箱培中保濕培養，24h后觀察記錄分生孢子萌發情況。每個處理觀察200個分生孢子，重復3次。

1.2.4 pH對菌絲生長和孢子萌發的影響

分別用1mol／L的鹽酸和氫氧化鈉溶液調節滅過菌的 OA培養基的pH 為3、4、5、6、7、8、9、10、11，每個培養皿倒入約15mL培養基，接種病原菌菌絲，置于25℃培養箱中光暗交替培養。7d后觀察菌落特征，并采用十字交叉法測量菌落大小。每個處理重復4次。

分別用不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10）的0.2%葡萄糖溶液配制分生孢子懸浮液［13］，在高倍鏡下每個視野20～30個分生孢子，用移液槍吸取15μL溶液在單凹玻片上，置于25℃霉菌培養箱中保濕培養，24h后觀察記錄分生孢子萌發情況。每個處理觀察200個分生孢子，重復3次。

1.2.5 光照對菌絲生長的影響

在PDA培養基平板上，接種病原菌菌絲，分別置于25℃培養箱中在完全光照、光暗交替、完全黑暗條件下培養。7d后觀察菌落特征并采用十字交叉法測量菌落大小。每個處理重復4次。

1.2.6 菌絲、分生孢子致死溫度測定

取未形成子實體的菌絲分裝離心管分別置于45、50、55、60、65℃恒溫水浴鍋中水浴處理10min，再接種至OA平板培養基上置于25℃的培養箱培養，7d后觀察菌落生長情況。每個處理重復4次。

用無菌水配制的孢子懸浮液倒入5個無菌的小試管（每管1mL），分別置于45、50、55、60、65℃的恒溫水浴鍋中水浴處理10min后，再接種至OA平板培養基上，置于霉菌培養箱25℃培養，7d后觀察菌落生長情況。每個處理重復4次。

2 結果與分析

2.1 培養基對菌絲生長的影響

5種培養基中，OA培養基上菌落直徑明顯比其他4種大，且菌落顏色明顯帶黃色，其他培養基上則為黑色至灰黑色（圖1）。PDA＋柚葉汁與PDA培養基菌落直徑存在極顯著差異，表明在PDA培養基上添加柚葉汁能促進該菌菌絲生長。PDA和MEA培養基菌落直徑無明顯差異，CHA培養基上最小。病原菌在5種培養基中培養15d后均能產生分生孢子（表1）。

圖1 柑橘葉點霉在不同培養基上的菌落特征

表1 不同培養基對菌絲生長的影響（25℃）1）

2.2 不同培養液對分生孢子萌發的影響

分生孢子在4種營養液中孢子萌發率均未達到25%以上；在0.2%葡萄糖溶液中孢子萌發率最高（17%），0.2%α－乳糖溶液和10%柚葉汁液中的萌發率次之，在水中的萌發率最低（1%）（圖2）。

2.3 溫度對菌絲生長和孢子萌發的影響

病菌菌絲在10～35℃范圍內均能生長，菌落顏色由淡黃色變為灰黑色或黑色。在10～25℃范圍內，菌絲隨著溫度的升高生長速度逐漸加快。在25～40℃范圍內，隨著溫度的升高菌絲生長速度逐漸減慢，40℃時菌絲停止生長。通過方差分析比較，菌絲在25～30℃范圍內的生長速率與在其他溫度上的存在極顯著差異，可見最適宜菌絲生長的溫度范圍為25～30℃。低溫（10、15℃）和高溫（40℃）條件下菌落均不產孢，菌絲生長明顯受抑制（表2）。分生孢子在15～35℃范圍內均能萌發，在15～25℃范圍內，孢子萌發率隨溫度升高而逐漸增大，25℃時孢子萌發率最大。在25～35℃范圍內，孢子萌發率隨溫度升高而逐漸減小（圖3）。

圖2 培養液對分生孢子萌發的影響

2.4 pH對菌絲生長和孢子萌發的影響

菌絲在pH4～11范圍都能生長，但在pH3時不能生長。結果分析表明，菌絲在pH5～7條件下的生長速率與其他pH上的存在極顯著差異，可見最適宜菌絲生長的pH為5～7。在pH4～11范圍內，培養7d后的菌落顏色隨著pH的增大由黑色逐漸變為黃色。菌絲生長16d后均能產孢，但pH11的產孢最少（表3）。分生孢子在pH3～9范圍內均能萌發，但pH10時不能萌發。

在pH3～6范圍內，隨著pH的增大孢子萌發率逐漸升高，到pH6時最高。在pH6～10范圍內，隨著pH增大，孢子萌發率逐漸降低（圖4）。

圖3 溫度對分生孢子萌發的影響

表2 溫度對菌絲生長和孢子萌發的影響（PDA）1）

表3 pH對菌絲生長的影響（OA，25℃）1）

2.5 光照對菌絲生長的影響

菌絲在12h光暗交替條件下生長最快，全光照生長次之，全黑暗生長最慢，但菌落顏色、菌落形態和產孢情況在3種處理中大致相同（表4）。

圖4 pH對分生孢子萌發的影響

表4 光照對菌絲生長的影響（PDA，25℃）1）

2.6 菌絲、分生孢子致死溫度測定

該病原菌菌絲和分生孢子經55℃以上水浴處理10min后，再轉移至OA培養基上25℃下培養7d，均未見菌絲生長和菌落形成，而在45、50℃水浴處理10min后的菌絲和分生孢子仍具有活性（培養7d后可見菌絲生長），由此表明55℃水浴處理該菌菌絲和分生孢子10min可使其失活。

3 結論與討論

本文系統研究了培養基、營養液、溫度、pH和光照對柑橘葉點霉菌絲生長、分生孢子形成和分生孢子萌發的影響。研究結果表明，柑橘葉點霉菌絲在不同培養基上生長，其菌落特征有差異，在OA培養基上菌落為黃色至黃黑色，而其他4種培養基上菌落顏色均未見黃色，這與Baldassri［14］研究報道一致，同時，Baldassri還指出利用OA培養基能有效地從形態特征鑒別Guignardiacitricarpa和Guignardiamangiferae。然而，Baayen［15］研究認為，菌絲除了在OA生長會出現黃色外，在CHA和MEA上生長均可見淡黃色，這可能與不同菌株和培養條件有關。

菌絲能在較寬的溫度范圍（10～35℃）和pH范圍（4～11）生長，表明該菌可能在自然條件下的適應性較強。Wager［16］研究認為菌絲在瓊脂培養基上最適生長溫度為24～27℃，這與筆者的研究結果較為吻合。在10℃時，菌絲生長明顯受到抑制，與Agostini［17］的研究結果一致，進一步說明了果實采收后低溫儲藏能減緩果實病斑的發展。光照對菌絲生長也有影響，12h光暗交替條件最有利于菌絲生長，這表明田間向陽的果實或葉片可能更有利于病菌的生長。分生孢子萌發試驗表明，該菌的分生孢子萌發率低，以在pH6的0.2%葡萄糖溶液中25℃下萌發最好，但Kiely［18］研究認為0.3%橘汁最適合分生孢子萌發，這可能與不同地區分生孢子特征及萌發營養液差異有關。

柑橘黑斑病是一種潛伏期很長的病害，從病原菌侵染成功到果實或葉片表現癥狀需要很長的時間。Baldassari［19］報道甜橘在人工接種成功后至少要55d才能初顯發病癥狀。一旦病原菌侵入果實后，在果實成熟期病斑會大量出現，將給果農帶來巨大的損失。Agostini提出了果實生長季節的化學防治措施和8℃的儲藏溫度能有效減少果實病斑的出現。因此，在生產實踐中，應結合病原菌的生物學特性，做好果實前期的病害預防工作，減少病源；在果實采收后，應注意保存的條件。目前，國內外有關柑橘黑斑病菌潛伏侵染機制尚不明確，有待今后進一步研究。

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Biological characteristics of the pathogen of citrus black spot

Lu Songmao， Luo Jinshui， Zhang Hanrong， Yu Zhicheng， Lin Zhiming， Lin Xiuxiang
（FujianInstituteofTropicalCrops，Zhangzhou363001，China）

The effects of different media，temperatures，pH and lights on mycelial growth and conidial germination were tested to understand the biological characteristics ofPhyllostictacitricarpa（McAlp.）Van der Aa causing the citrus black spot.The results showed that the optimum medium for mycelial growth was oatmeal agar（OA）.For mycelial growth，the optimum temperature was 25－30℃，and the optimum pH was 5－7.It grew the fastest under alternate light and darkness every 12 hours，but the slowest in darkness.The optimum temperature for conidial germination was 25℃，and the optimum pH was 6.If the conidia grew in0.2%glucose solutions，the percentage of conidial germination was the highest.The lethal temperature for the conidium and mycelium was 55℃，lasting for 10 minutes.

citrus black spot；Phyllostictacitricarpa； biological characteristics

S 436.661.1

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.009

2012－01－31

2012－02－29

福建省公益類基本科研專項（2009R10010－1）；福建省自然科學基金項目（2010J01113）