對斜紋夜蛾高效綠僵菌的篩選

馬麗娟， 滕忠才， 臧 歡， 劉廷輝，李瑞軍＊， 郭 巍， 鞏蘭菊

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，保定 071001；2.保定學(xué)院生化系，保定 071000；3.河北省曲周縣農(nóng)牧局，曲周 057250）

對斜紋夜蛾高效綠僵菌的篩選

馬麗娟1， 滕忠才2， 臧 歡1， 劉廷輝1，李瑞軍1＊， 郭 巍1， 鞏蘭菊3

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，保定 071001；2.保定學(xué)院生化系，保定 071000；3.河北省曲周縣農(nóng)牧局，曲周 057250）

對從土壤中分離到的金龜子綠僵菌中生長性狀較好的6個菌株，通過測定對黃粉蟲幼蟲的僵蟲率和致死中時，選出3株致病效果好的菌株 M7－9、M7－（16－18）、M7－（64－65），再采用點滴法接種對斜紋夜蛾進行毒力測定。結(jié)果表明，不同菌株對斜紋夜蛾的毒力與菌株種類有密切關(guān)系，3株菌株對斜紋夜蛾的LT50分別為2.70、3.07、5.79d。以此3株菌進行抗高溫及抗紫外線試驗，菌株M7－9和M7－（16－18）對高溫和紫外線都具有較好的抗性，且M7－9對紫外線的抗性強于M7－（16－18），兩菌株均具有進一步研究的價值。

金龜子綠僵菌； 斜紋夜蛾； 生物測定； 篩選

斜紋夜蛾［Spodopteralitura（Fabricius）］屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是一種世界性分布的重要農(nóng)業(yè)害蟲，食性廣，繁殖力強，發(fā)生為害嚴(yán)重［1］。近年來，斜紋夜蛾已成為各種農(nóng)作物上的常發(fā)性害蟲，我國斜紋夜蛾的危害愈加嚴(yán)重，已由過去的間歇性、偶發(fā)性、次要性害蟲迅速上升為常發(fā)性、暴發(fā)性的農(nóng)業(yè)大害蟲［2］，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、園林綠化等都造成了嚴(yán)重的損失，在長江流域的棉花和蔬菜上可發(fā)生4～6代／年［3］。目前，對于斜紋夜蛾的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥，然而長期、連續(xù)的不加區(qū)別地濫用各類化學(xué)殺蟲劑，已經(jīng)使得斜紋夜蛾對諸多殺蟲劑的活性成分產(chǎn)生不同程度的抗性［4］，甚至產(chǎn)生對多種藥物的交叉抗性，使田間防治愈加困難［5］。同時，化學(xué)農(nóng)藥毒性高、殘留量大，對人們的健康以及環(huán)境都存在較大威脅。因此，積極尋找高效低毒的替代方法對斜紋夜蛾進行防治是目前無公害蔬菜生產(chǎn)上亟須解決的問題。

綠僵菌作為當(dāng)今世界應(yīng)用最為廣泛的一種昆蟲病原真菌，因?qū)ハx的致病力強、寄主范圍廣，對人、畜、作物無毒害而受到重視［6－9］。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌能夠寄生的昆蟲有200余種，對有些害蟲已開發(fā)出綠僵菌殺蟲劑，并收到良好防治效果［10］。但由于綠僵菌對環(huán)境要求較高，對高溫、陽光尤其紫外線高度敏感，阻礙了它作為生物殺蟲劑的發(fā)展進程。因此，獲得具有高毒力、高抗性的菌株將成為今后工作的重中之重。

土壤是綠僵菌資源的寶庫，為綠僵菌提供了廣泛的生存空間，本實驗室通過黃粉蟲誘集法從土壤中已分離出150株金龜子綠僵菌。本研究通過對從土壤中分離到的金龜子綠僵菌中生長性狀較好的6個菌株進行毒力測定及抗性篩選，旨在獲得具有較高毒力及較好抗逆性的菌株，為今后的防治工作提供良好的基礎(chǔ)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蟲源與飼養(yǎng)

黃粉蟲［TenebriomolitorLinnaeus］、斜紋夜蛾［Spodopteralitura（Fabricius）］為本實驗室人工飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度28～30℃、相對濕度40%～70%、光周期L∥D＝16h∥8h。

1.1.2 供試金龜子綠僵菌菌株

供試6株金龜子綠僵菌為本實驗室從各地土壤中分離（表1），用PPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

M7－9 滕莊 蔥 2010－07 －4 3 菌落絨毛狀，分生孢子橄欖綠色M7－（16－18） 郎莊 茄子2010－07 －4 3 菌落絨毛狀，分生孢子橄欖綠色M7－（64－65） 郎莊 韭菜2010－07 －4 3 菌落絨毛狀，分生孢子橄欖綠色M7－105 小汲村 甘薯2010－07 －4 3 菌落絨毛狀，分生孢子橄欖綠色M7－169 西馬池 香麥2010－07 －4 3 菌落絨毛狀，分生孢子橄欖綠色M7－149 南大園 玉米2010－07 －4 3 菌落絨毛狀，分生孢子橄欖綠色

1.1.3 培養(yǎng)基

PPDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蛋白胨20g、蒸餾水1 000mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤中金龜子綠僵菌的分離

1.2.1.1 土壤采集

選擇平整規(guī)則的采集地點，每個地點在附近取5個樣點，除去表土（2～3cm），選取表層以下20cm內(nèi)的土壤1kg，除去石塊等大的雜物后充分混合，取出一半后混勻，余下的再取出一半混勻，最后取0.5～1kg于塑料袋，附上標(biāo)簽，寫明采集地點、采集深度、采集日期、采集地植被等。

1.2.1.2 金龜子綠僵菌的誘集

將供試土樣分裝于市售的500mL一次性大塑料杯中，每個土樣3杯，每杯盛土200g左右，放入3頭黃粉蟲幼蟲，搖動杯子，使土樣將蟲體覆蓋，加入適量無菌水使土樣濕度接近飽和，保鮮膜封住杯口，用昆蟲針扎小孔若干，室溫下保濕培養(yǎng)，逐日觀察記載黃粉蟲的存活狀況和幼蟲感病后的癥狀，若蟲體僵硬，體表覆蓋有橄欖綠色的粉狀物，可初步判定土樣中存在金龜子綠僵菌并誘集成功。

1.2.1.3 金龜子綠僵菌的分離純化及鑒定

將蟲體上的分生孢子稀釋，于PPDA培養(yǎng)基上畫線分離純化。經(jīng)顯微鏡觀察其形態(tài)，通過分生孢子的顏色、形態(tài)及分生孢子梗等特征，在顯微鏡下進行種類鑒定，確定是金龜子綠僵菌后，挑取菌落斜面培養(yǎng)，保存。

1.2.2 金龜子綠僵菌生物活性測定

1.2.2.1 菌懸液的制備

將菌種先接種于PPDA培養(yǎng)基上，（25±1）℃恒溫培養(yǎng)10d，刮取孢子置于研磨器中，用0.05%吐溫－80無菌水配制成濃度為1×108個／mL的孢子懸液。

1.2.2.2 6株金龜子綠僵菌菌株對黃粉蟲致病力的初步測定

用移液槍吸取上述菌液滴于5齡黃粉蟲腹部背板，接種量為10μL，對照組用等量0.05%吐溫－80無菌水接種，設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)15頭試蟲。處理后放入養(yǎng)蟲盒中，用新鮮洋白菜葉片作食料，每天更換1次。在飼養(yǎng)條件下連續(xù)觀察10d，每天記錄試蟲的死亡數(shù)、僵蟲數(shù)，用DPS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析［11］。

1.2.2.3 3株高毒力金龜子綠僵菌菌株對斜紋夜蛾的毒力測定

選取上述試驗中毒力表現(xiàn)較好的 M7－9、M7－（16－18）、M7－（64－65）金龜子綠僵菌菌株，進一步測定。菌種培養(yǎng)、毒力測定、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法同1.2.2.2，菌懸液孢子濃度范圍為1×104～1×108個／mL，試蟲為斜紋夜蛾。

1.2.3 金龜子綠僵菌抗逆性試驗

1.2.3.1 菌懸液的制備

選上述3株金龜子綠僵菌進行培養(yǎng)，并配制菌懸液，方法同1.2.2.1。順次稀釋，配制成終濃度為1×105個／mL的孢子懸液。

1.2.3.2 高溫對綠僵菌菌株的影響

（1）高溫處理對綠僵菌分生孢子萌發(fā)率的影響

無菌條件下，將孢子懸浮液分裝至小燒杯，保鮮膜封口。將燒杯分別置于溫度為35、40、45、50℃的水浴鍋中處理。處理時間30min。取處理的孢子懸液1μL涂布于PPDA平板培養(yǎng)基，以未經(jīng)處理為對照，分別設(shè)3次重復(fù)。置于恒溫培養(yǎng)箱中，（25±1）℃條件下培養(yǎng)3d，計成菌落數(shù)，計算各菌株各處理的孢子萌發(fā)率。

（2）高溫處理對綠僵菌菌落生長的影響

取1.2.3.1中處理過的孢子懸液10μL滴到PPDA平板中央，以未經(jīng)處理為對照，分別設(shè)3次重復(fù)。置于恒溫培養(yǎng)箱中，（25±1）℃條件下培養(yǎng)，自第3天開始測量菌落直徑直至第7天，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3.3 紫外線對綠僵菌菌株的影響

（1）紫外處理對綠僵菌分生孢子萌發(fā)率的影響

根據(jù)胡瓊波的方法［12］，吸取孢子懸浮液1μL均勻涂布于PPDA平板，將平板置于超凈工作臺紫外燈下，分別照射1、2、4、6、10min后，于（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以未經(jīng)照射為對照，每個處理設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)3d后記錄各處理平板中菌落數(shù)，計算各菌株各處理的孢子萌發(fā)率。

（2）紫外處理對綠僵菌菌落生長的影響

吸取孢子懸浮液10μL滴至PPDA培養(yǎng)基中央，根據(jù)胡瓊波的方法［12］置于超凈工作臺紫外燈下，分別照射1、2、4、6、10min，將平板置于（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以未經(jīng)照射為對照，每個處理設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)第3天起測量菌落直徑直至第7天，記錄數(shù)據(jù)。

以上數(shù)據(jù)均用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理［11］，記錄其均值、標(biāo)準(zhǔn)差及各處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 6株金龜子綠僵菌菌株對5齡黃粉蟲的致病力

6株金龜子綠僵菌菌株對黃粉蟲致病力的初步測定結(jié)果見表2。由表2可知，供試菌株對黃粉蟲均有致病性，致死中時間在2.64～5.14d之間。其中菌株 M7－9、M7－（16－18）、M7－（64－65）的致死中時分別為2.64、3.51d和3.92d，僵蟲率也明顯高于其他菌株，與其他綠僵菌菌株間差異顯著，顯示其具有較高的毒力。

表2 6株金龜子綠僵菌菌株對5齡黃粉蟲的致死中時1）

2.2 3株高毒力金龜子綠僵菌菌株對斜紋夜蛾的毒力測定

由表2可知，菌株 M7－9、M7－（16－18）、M7－（64－65）對黃粉蟲的致病力較高。所以選擇 M7－9、M7－（16－18）、M7－（64－65）進行對斜紋夜蛾的毒力測定，結(jié)果見表3。

表3 3株高毒力金龜子綠僵菌對斜紋夜蛾的致死中時

由表3可知，3株綠僵菌對試蟲的致死中時差異較大，不同菌株對斜紋夜蛾的LT50從小到大依次為：M7－9＜M7－（16－18）＜M7－（64－65）。綜合測定結(jié)果可知，M7－9的致死時間最短，綜合防治效果最好，是比較理想的生防菌株。

根據(jù)馮明光的方法［13］，運用時間－劑量－死亡率模型（又稱 TDM 模型）分析了 M7－9、M7－（16－18）和M7－（64－65）菌株劑量效應(yīng)隨時間變化和時間效應(yīng)隨劑量變化的趨勢信息、互作效應(yīng)。各處理劑量與時間效應(yīng)參數(shù)的t測驗值均達到極顯著水平（p＜0.01），說明供試菌株的劑量效應(yīng)與時間效應(yīng)極顯著。根據(jù)所估計參數(shù)而建立的CLL模型，可以完整地描述所測菌株對斜紋夜蛾的時間與劑量效應(yīng)，結(jié)果見圖1。圖1模擬的死亡率是一個曲面，根據(jù)曲面的變化，在試驗范圍內(nèi)，其累計死亡率與處理的孢子劑量、處理后的時間呈正相關(guān)，即隨著劑量的增加累計死亡率增加，隨著時間的延長累計死亡率增加。

圖1 斜紋夜蛾在3株金龜子綠僵菌作用下隨時間和劑量變化的累計死亡率三維圖

2.3 抗逆性試驗

2.3.1 高溫對綠僵菌菌株的影響

2.3.1.1 高溫處理對綠僵菌分生孢子萌發(fā)率的影響

高溫處理對3株綠僵菌分生孢子萌發(fā)率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，供試菌株對高溫處理比較敏感，通過觀察，在溫度低于45℃時，菌株M7－9和菌株 M7－（16－18）對溫度的耐受性都比較明顯，分生孢子的萌發(fā)率仍可達到80%以上。在溫度為45℃時，菌株M7－9分生孢子有45%以上可萌發(fā)。

圖2 高溫處理對綠僵菌分生孢子萌發(fā)的影響

2.3.1.2 高溫處理對綠僵菌菌落生長的影響

通過培養(yǎng)高溫處理后的3株綠僵菌，分別于3～7d測量菌落的生長情況，各菌株對高溫的耐受性結(jié)果見圖3。

通過觀察，3株菌在未經(jīng)處理時，菌落生長差異不明顯。隨著溫度升高，各菌株表現(xiàn)出不同的生長情況，其中菌株 M7－9對高溫比較不敏感，在溫度為40℃和50℃時都表現(xiàn)出良好的生長態(tài)勢。結(jié)合2.3.1.1中結(jié)果，初步推斷可能由于高溫抑制了孢子萌發(fā)時間，但在孢子萌發(fā)后，菌株M7－9生長迅速。在溫度為40℃和50℃時菌株M7－（16－18）的菌落生長情況優(yōu)于對照，可能由于特定的溫度促進了菌落的生長。

2.3.2 紫外線對綠僵菌菌株的影響

2.3.2.1 紫外處理對綠僵菌分生孢子萌發(fā)率的影響

紫外處理對3株綠僵菌分生孢子萌發(fā)率的影響結(jié)果見圖4?？梢钥闯觯?株綠僵菌對紫外線處理都比較敏感，隨著紫外線照射時間的增加，綠僵菌菌株 分生孢子的萌發(fā)率呈遞減趨勢。

圖3 高溫處理對綠僵菌菌落生長的影響

圖4 紫外處理對綠僵菌分生孢子萌發(fā)的影響

2.3.2.2 紫外處理對綠僵菌菌落生長的影響

紫外處理對3株綠僵菌菌落生長的影響結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，3株綠僵菌中，菌株 M7－9對紫外線抗性最好。紫外照射對菌落生長影響相對不明顯，菌株 M7－（16－18）對紫外的抗性比較好。菌株M7－（64－65）受紫外線影響較大，在照射10min后培養(yǎng)7d仍沒有菌落生長?？棺贤庑Ч筛叩降鸵来螢椋篗7－9＞M7－（16－18）＞M7－（64－65）。

3 結(jié)論與討論

通過比較6株金龜子綠僵菌對5齡黃粉蟲的致死中時，獲得了3株毒力較高的菌株，經(jīng)測定它們對斜紋夜蛾的致死中時，篩選出具有較高毒力的菌株M7－9，其對斜紋夜蛾的致死中時為2.70d，大大低于來有鵬、張登峰［14］報道的布氏白僵菌菌株對斜紋夜蛾2齡幼蟲的致死中時4.10d。

通過對菌株 M7－9、M7－（16－18）和 M7－（64－65）進行抗高溫和抗紫外線試驗，3株綠僵菌中對高溫和紫外抗性最好的為M7－9，該菌在溫度為40℃和45℃時分生孢子的萌發(fā)率分別為81.00%和46.00%，紫外處理10min分生孢子萌發(fā)率為28.33%。黃志、梁昌聰［15］等測定了綠僵菌菌株JF－813對高溫和紫外線的抗逆性，該菌在溫度為40℃和45℃時分生孢子萌發(fā)率分別為54.20%和24.2%，紫外處理5min和10min時分生孢子萌發(fā)率分別為34.0%和11.9%。本研究所用金龜子綠僵菌菌株由保定地區(qū)不同作物土壤中分離獲得，這些菌株在室內(nèi)生物測定中均表現(xiàn)出較強的致死力。尤其是菌株M7－9，除對試蟲表現(xiàn)出高致病性外，對高溫和紫外線也表現(xiàn)出一定的抗性。這說明保定地區(qū)綠僵菌資源豐富、優(yōu)良，通過篩選獲得的金龜子綠僵菌對本地區(qū)有害生物防治具有良好的應(yīng)用前景。

圖5 紫外處理對綠僵菌菌落生長的影響

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Screening of high virulence strains ofMetarhiziumanisopliaeagainstSpodopteralitura

Ma Lijuan1， Teng Zhongcai2， Zang Huan1， Liu Tinghui1， Li Ruijun1， Guo Wei1， Gong Lanju3
（1.CollegeofPlantProtection，HebeiAgriculturalUniversity，BiologicalControlCenterofPlant DiseasesandPestsofHebeiProvince，Baoding071001，China；2.DepartmentofBiochemistry，BaodingUniversity，Baoding071000，China；3.AgricultureandAnimalHusbandryBureauofQuzhouCounty，Quzhou057250，China）

Six strains ofMetarhiziumanisopliaewith good growth traits，isolated from soil in Baoding area，were screened againstTenebriomolitorLinnaeus by bioassay.Among them，M7－9，M7－（16－18）and M7－（64－65）strains，which showed higher virulence than other isolates，were selected to test their pathogenicity againstSpodopteralitura（Fabricius）.The LT50of strain M7－9，M7－（16－18）and M7－（64－65）againstS.liturawere 2.70，3.07 and 5.79 d，respectively.The 3strains were then treated with the ultraviolet ray and heat.The results demonstrated that the resistance of M7－9 and M7－（16－18）to high temperature and ultraviolet ray was higher，and the resistance of M7－9 to the ultraviolet ray was higher than that of M7－（16－18）.These results suggested that strains M7－9 and M7－（16－18）have better exploitation and application value in the future.

Metarhiziumanisopliae；Spodopteralitura； bioassay； screen

S 476.12

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.015

2012－01－06

2012－03－23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS－14）

＊ 通信作者E－mail：liruijun99＠sina.com