高效液相色譜柱后衍生法測定農田溝渠水中草甘膦殘留

王 聰， 劉穎超＊， 龐民好， 董金皋

（1.河北農業大學植物保護學院，保定 071000；2.河北農業大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室，保定 071000）

高效液相色譜柱后衍生法測定農田溝渠水中草甘膦殘留

王 聰1， 劉穎超1＊， 龐民好1， 董金皋2＊

（1.河北農業大學植物保護學院，保定 071000；2.河北農業大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室，保定 071000）

為了準確評價草甘膦在農田溝渠水中使用后其對生態環境的安全性，建立了高效液相色譜（HPLC）－柱后衍生法對農田溝渠水中草甘膦殘留量的檢測方法。將田間溝渠水樣中草甘膦經次氯酸鈉和鄰苯二甲醛、巰基乙醇衍生化后，采用熒光檢測器檢測。衍生劑1（5%）次氯酸鈉添加量100μL／L；衍生劑2硼酸鉀和OPA添加量分別是130g／L和100mg／950mL。草甘膦在0.05～2mg／L范圍內線性良好，相關系數為0.999 9。在農田溝渠水中，草甘膦3個添加水平（0.05、0.5、1mg／L）的平均回收率（n＝5）為98.2%～104.4%，5次測量的相對標準偏差為2.1%～3.6%，方法檢出限為0.05mg／L。該方法靈敏、簡便、快速，適合于農田溝渠水中草甘膦殘留量的檢測。

高效液相色譜； 柱后衍生； 農田溝渠水； 草甘膦

草甘膦（glyphosate，分子式為C3H8NO5P，化學結構見圖1）屬滅生性輸導型莖葉處理劑，具有廣譜、高效、低毒、低殘留的特點。農業生物技術應用國際服務組織 （ISAAA）最新統計報告，2009年全世界轉基因作物（大豆、玉米、苜蓿等）種植面積已達1.34億hm2。隨著轉基因作物大面積種植，草甘膦在世界除草劑應用中越來越受到人們的歡迎，廣泛用于農田各種雜草的防除和非農田雜草的治理，現已成為應用最廣、產量最大的除草劑品種［1－2］。然而，草甘膦的大量使用對環境造成的影響是不可忽視的。草甘膦對人畜低毒，一直以來被認為是“安全”的除草劑，但近些年的研究顯示環境中的草甘膦能夠造成大量益蟲死亡，對水生生物也具有極強的毒性［3］。朱國念等通過室內外試驗，探索了草甘膦對水蚤、藻類和魚的毒性效應以及在水中的殘留動態［4］。此外，草甘膦還能夠使土壤中的微生物種群比例發生改變，造成一些有益微生物活性降低，土壤有機質含量下降，從而降低土壤的質量。鄧曉等研究表明草甘膦對土壤微生物的種群數量及土壤中細菌、放線菌和真菌生長速率均具有一定的抑制作用［5］。這些研究為保障生物生存環境的安全提供了科學依據。

圖1 草甘膦的化學結構示意圖

雖然草甘膦在防除雜草方面發揮著良好的作用，但由于其易溶于水，難溶于一般有機溶劑，缺少發色團和熒光團，對其分析測定難度很大［6］，尤其在環境中有其他常見化合物存在情況下，進行痕量測定愈加困難［7］。目前，測定草甘膦的方法主要有氣相色譜法［8］、氣相色譜－質譜法［9］、高效液相色譜－串聯質 譜 法［10］、高效液 相 色 譜 法［11－14］、離 子 色 譜法［15］、分光光度法［16］、毛細管電泳法［17］等，但這些方法均具有局限性。例如：氣相色譜法操作步驟繁瑣，重現性差，同時限制了常用的各種標準衍生技術；氣相色譜－質譜聯用法靈敏度高，但成本高且普及率低，前處理繁瑣，不利于大批量樣品處理；分光光度法檢測的靈敏度低，干擾性大；柱前衍生高效液相色譜法中的柱前衍生試劑易與水反應生成副產物，并且有些衍生試劑毒性較大［10］。為了快速、準確、高靈敏度測定農田溝渠水中草甘膦的殘留，本文建立了高效液相－柱后衍生法測定農田溝渠水中草甘膦含量的方法，試驗證明了該方法靈敏度和精確度高，干擾少且成本相對低，重現性好，能直接進樣測定，適合于大批量樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜系統（美國Agilent公司）：包括脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、熒光檢測器（FLD）；PCX5200柱后衍生儀配二元泵（美國Pick－ering Laboratories公司）；科導SK2210LHC超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；SK－1快速混勻器（上海滬粵科學儀器有限公司）。

1.2 試劑

99%草甘膦標準品（上海江萊生物科技有限公司）；磷酸，氫氧化鉀，次氯酸鈉，氯化鈉，氫氧化鈉，磷酸二氫鉀，硼酸鉀，以上均為國產分析純；甲醇，巰基乙醇（色譜級，美國 Pickering Laboratories公司），鄰苯二甲醛（OPA，化學純，國藥集團化學試劑有限公司），超純水（自制），甘氨酸（Amresco）。

1.3 溶液的配制

流動相：鉀洗脫液（0.4%磷酸－0.1%磷酸二氫鉀水溶液；pH＝2）；再生液（0.3%氫氧化鉀水溶液）；

衍生試劑1：5%次氯酸鈉100μL，加入950mL GA116（1% 氯化鈉，0.1%磷酸二氫鉀，0.1%氫氧化鈉水溶液；pH＝12）；

衍生試劑2：100mg OPA用10mL甲醇溶解，同時與2mL巰基乙醇加入到950mL的GA104（13%硼酸鉀的水溶液；pH＝9.8）中，使用前通氮氣去氧（10～15min）。

1.4 HPLC－柱后衍生測定條件

1.4.1 色譜柱

分析柱：鉀陽離子交換柱（50×4.0mmi.d.），保護柱：鉀陽離子交換柱（20×3.0mmi.d.）（美國Pickering Laboratories公司）。

1.4.2 柱后衍生條件

進樣體積：10μL；流動相流量：0.4mL／min；衍生劑1流速：0.3mL／min；衍生劑2流速：0.3mL／min；柱溫：55℃；柱后衍生反應器溫度：36℃；

檢測器：熒光檢測器設定的激發波長λEX＝330nm，發射波長λEM＝465nm。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫和流速

1.5 樣品處理

采集不少于1kg農田溝渠水樣品，4層紗布過濾，準確量取25.0mL濾液于50mL離心管中，5 000r／min離心30min，上清液用濾紙過濾，濾液過0.22μm濾膜后進行檢測。

2 結果與分析

2.1 衍生化條件的選擇

2.1.1 衍生劑1中次氯酸鈉對衍生效率的影響

衍生劑1是由氯化鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、次氯酸鈉組成的體系，該體系的pH＝12。在同一個草甘膦濃度下，設定5%次氯酸鈉的7個添加量，在1 000mLGA116中，分別添加40、60、80、100、120、140、160μL進行測定（圖2）。可以看出，次氯酸鈉的量影響衍生效果。當添加量小于80μL時，隨著次氯酸鈉添加量的增加，響應值逐漸增大；當大于80μL時，隨著次氯酸鈉添加量的增加響應值基本不發生變化。因此選取100μL作為后繼試驗的添加量。

圖2 次氯酸鈉量的選擇

2.1.2 衍生劑2中OPA、硼酸鉀對衍生效果的影響

衍生劑2由硼酸鉀、鄰苯二甲醛（OPA）、巰基乙醇的體系組成。固定鄰苯二甲醛、巰基乙醇的量，改變反應緩沖液中硼酸鉀的鹽濃度，向1 000mL溶液中分別添加20、30、40、60、80、100、130g硼酸鉀進行測定（圖3）。草甘膦濃度相同時，隨著硼酸鉀添加量的增加，響應值逐漸增大；添加量為130g／L時，硼酸鉀在水中達到了飽和，此時響應值最大。因此選取130g／L作為后繼試驗的添加量，此時溶液的pH＝9.8。

圖3 硼酸鉀濃度的選擇

OPA添加量的設置：在GA104分別添加40、60、80、100、200、250、300mg OPA進行測定（圖4）。可以看出，草甘膦濃度相同時，OPA添加量的多少影響衍生效果，OPA添加量高于80mg后，響應值開始趨于平穩，因此選擇100mg／950mL作為添加量。

以上試驗結果表明，草甘膦衍生反應效率受多個因素的影響，本試驗所涉及的因子中，流動相的組成百分比及pH，次氯酸鈉和硼酸鉀等的反應量均與衍生效率密切相關。

圖4 鄰苯二甲醛濃度的選擇

2.2 標準曲線的繪制

配制草甘膦標準液濃度為 0.05、0.1、0.5、1.0mg／L和2.0mg／L；以峰面積定量y對濃度x（mg／L）進行回歸分析，草甘膦的回歸方程為y＝36.464x＋0.221 1，相關系數R2＝0.999 9。

2.3 方法的準確度、靈敏度和精密度

方法的準確度可用添加回收率表示。在農田溝渠水中設置3個添加水平：0.05、0.1、1mg／L。每個添加水平平行測定5次，平均回收率98.2%～104.4%；相對標準偏差（RSD）2.1%～3.6%（表2）。以農田溝渠水的最低添加量作為檢出限0.05mg／L。達到農藥殘留分析對靈敏度的要求。農田溝渠水的空白和添加草甘膦樣品譜圖見圖5。由圖5可知，0.05mg／L和1mg／L草甘膦分別在農田溝渠水中的添加回收率的峰形較好。

表2 農田溝渠水草甘膦的添加回收率

圖5 空白樣品和草甘膦加標樣品色譜圖

3 結論與討論

本文確立了農田溝渠水中草甘膦的高效液相色譜柱后衍生檢測方法。草甘膦在0.05～2mg／L范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 9，添加水平為0.05～1mg／L的平均回收率為98.2%～104.4%，相對標準偏差為2.1%～3.6%，方法檢出限為0.05mg／L。中國草甘膦 MRL值為0.5～1mg／L，本方法能滿足農田溝渠水中草甘膦的殘留量檢測。

試驗過程中發現，使用不同批次配制的流動相，草甘膦的保留時間會略有變化，但對測定結果不產生影響。根據柱后衍生原理，甘氨酸可能對草甘膦測定產生干擾，因此采用本文建立的方法對甘氨酸進行了測定。結果表明，本試驗中甘氨酸對草甘膦的測定不產生干擾作用。

高效液相色譜柱后衍生法檢測草甘膦是通過色譜柱將草甘膦與雜質分離，柱后衍生系統將其在線衍生為異吲哚物質，熒光檢測器檢測，靈敏度高。農田溝渠水經過沉淀過濾即可直接進樣檢測，處理方法簡單。結合自動進樣器能大批量自動衍生檢測樣品，省工省時。同時在線衍生避免了柱前人工衍生造成的誤差，精密度高。常規柱前衍生反應需控制在一定時間內，不易大批量衍生樣品，并且柱前衍生應用的衍生試劑鄰硝基苯磺酰氯、二硝基氟苯等毒性大，在開放環境的操作過程對人體危害大［10，18］。而柱后衍生試劑是封閉系統中在線自動完成，對人體危害小。

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Determination of glyphosate in the water of farmland ditch by high performance liquid chromatography－post column derivation

Wang Cong1， Liu Yingchao1， Pang Minhao1， Dong Jingao2
（1.CollegeofPlantProtection，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China；2.MycotoxinandMolecularPlantPathologyLaboratory，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China）

In order to accurately evaluate the bio－environmental safety of glyphosate，a HPLC－post column derivation method was developed to determine glyphosate in the water of farmland ditch.Glyphosate in the water of farmland ditch was derivatized with the sodium hypochlorite，o－phthalic aldehyde and mercaptoetha－nol，which were detected withfluorescence detector.The 5%sodium hypochlorite volume of derivative 1 was 100μL／L；potassium borate and OPA volumes of derivative 2 were 130 g／L and100 mg／950 mL，respectively.The linearities of glyphosate were at the concentration range of 0.05 to 2.0mg／L，with a correlation coefficient of 0.999 9.The mean spiked recoveries of glyphosate at 3 spiked levels ranged from98.2%to 104.4%.The relative standard deviations（RSD，n＝5）were 2.1%－3.6%.The limit of detection was 0.05 mg／L.This method is sensitive，simple，rapid and suitable for determining glyphosate in the water of farmland ditch.

high performance liquid chromatography； post column derivation； the water of farmland ditch；glyphosate

TQ 450.263

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.019

2011－11－24

2011－12－26

現代農業產業技術體系專項基金（CARS－02）

＊ 通信作者E－mail：liuyingchao＠hebau.edu.cn，dongjingao＠126.com