花園蔥蝸牛形態(tài)學(xué)與PCR檢測(cè)鑒定技術(shù)

肖 瓊， 楊海芳， 艾洪木， 周衛(wèi)川

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002；2.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，國(guó)家軟體動(dòng)物檢疫鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350001；3.中國(guó)濕地博物館，杭州 310013）

花園蔥蝸牛形態(tài)學(xué)與PCR檢測(cè)鑒定技術(shù)

肖 瓊1，2， 楊海芳3， 艾洪木1， 周衛(wèi)川2＊

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002；2.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，國(guó)家軟體動(dòng)物檢疫鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350001；3.中國(guó)濕地博物館，杭州 310013）

花園蔥蝸牛（CepaeahortensisMüller）是我國(guó)新增的進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄中的成員，該螺與近似種在貝殼形態(tài)上難以鑒別。本文應(yīng)用貝殼、軟體解剖和PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，研究了花園蔥蝸牛的檢測(cè)鑒定技術(shù)，結(jié)果表明，PCR方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，并與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，該方法為非軟體動(dòng)物分類(lèi)專業(yè)的檢疫人員檢測(cè)鑒定花園蔥蝸牛提供了快速簡(jiǎn)便的技術(shù)方法。

花園蔥蝸牛； 植物檢疫； PCR； 鑒定

花園蔥蝸牛（CepaeahortensisMüller）隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)，腹足綱，柄眼目，大蝸牛科，蔥蝸牛屬，是我國(guó)新修訂的進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄中的成員之一，原產(chǎn)于歐洲，現(xiàn)已經(jīng)入侵至北美［1－3］，該螺在我國(guó)尚未分布，加強(qiáng)檢疫是防治該螺最為經(jīng)濟(jì)有效的技術(shù)措施。近年來(lái)，我國(guó)口岸從歐美進(jìn)境的原木和集裝箱以及箱內(nèi)貨物的木質(zhì)包裝材料中多次截獲該蝸牛，表明該螺入侵的風(fēng)險(xiǎn)較大［4］。

花園蔥蝸牛與其近似種，尤其是森林蔥蝸牛（CepaeanemoralisLinnaeus）在貝殼形態(tài)上難以鑒別，歷史上學(xué)名應(yīng)用十分混亂，給我國(guó)的實(shí)際檢疫工作造成了被動(dòng)，也是世界各國(guó)檢疫工作中共同面臨的技術(shù)難題。最近20多年來(lái)，分子系統(tǒng)學(xué)飛速發(fā)展，即通過(guò)基因序列的比對(duì)和分析可以厘清物種的分類(lèi)學(xué)地位［5－7］，因此可以應(yīng)用貝殼、解剖和分子特征相結(jié)合的方法，對(duì)花園蔥蝸牛及其近似種的分類(lèi)學(xué)進(jìn)行更為深入而詳盡的研究，為花園蔥蝸牛的快速準(zhǔn)確鑒定提供新的技術(shù)手段。目前，軟體動(dòng)物分類(lèi)專業(yè)的檢疫人員相當(dāng)匱乏，而PCR技術(shù)在國(guó)境口岸檢疫部門(mén)已經(jīng)普及，如果能設(shè)計(jì)出特異性引物用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行初選或鑒定，這個(gè)難題就迎刃而解。本文將應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，研究花園蔥蝸牛的檢測(cè)鑒定技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

建立PCR檢測(cè)方法的供試材料為花園蔥蝸牛成螺，產(chǎn)地意大利。驗(yàn)證PCR方法的材料為各口岸局送鑒的軟體動(dòng)物，包括花園蔥蝸牛、近似種森林蔥蝸牛和其他蝸牛（表1）。

1.2 主要試劑

天根生化科技（北京）有限公司的血液／細(xì)胞／組織基因組DNA提取試劑盒；2×TaqPCR Master Mix（組成為0.1UTaqPolymerase／μL；500mol／L dNTP each；20mol／L Tris－HCl（pH 8.3）；100mol／L KCl；3 mol／L MgCl2；其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑）、DNA Marker I均購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的準(zhǔn)備

取花園蔥蝸牛的軟體腹足部分約0.1g，加液氮研磨。

1.3.2 DNA模板的制備

利用TIANGEN組織基因組DNA提取試劑盒提取，按使用說(shuō)明書(shū)操作提取DNA，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設(shè)計(jì)與合成

將提取的花園蔥蝸牛DNA，用無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ（cytochrome oxidaseⅠ，COⅠ）這一基因特定區(qū)段的通用引物L(fēng)CO－1490 5′－GGTCAACAACA ATCATAAAGATATTGG－3′；HCO－2198 5′－TAAACTTC AGGGTGACCAAAAAATCA－3′［17］擴(kuò)增并測(cè)序，獲得花園蔥蝸牛COⅠ基因特定片段序列，然后用Primer 5和Oligo Demo 6軟件，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則［18］設(shè)計(jì)花園蔥蝸牛的物種特異性引物 HY（01）、HY（02）。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系的總體積為20μL，其中2×TaqPCR Master Mix 10μL，引物各0.5μL，DNA模板2μL，然后加水至20μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃5min，95℃50s，55℃30s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)，72℃10min。

1.3.5 特異性試驗(yàn)

以花園蔥蝸牛為陽(yáng)性對(duì)照，按試劑盒方法提取經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定確認(rèn)為森林蔥蝸牛、散大蝸牛、蓋罩大蝸牛、斯文豪大蝸牛和灰尖巴蝸牛的DNA，先用通用引物L(fēng)CO－1490和 HCO－2198進(jìn)行PCR擴(kuò)增以證實(shí)DNA提取成功，然后再用特異性引物 HY（01）、HY（02）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，以檢測(cè)該引物的特異性。

1.3.6 靈敏度試驗(yàn)

將花園蔥蝸牛DNA模板進(jìn)行104倍系列稀釋：10－4倍，10－8倍，10－12倍，10－16倍，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定檢測(cè)方法的靈敏度。

1.3.7 PCR檢測(cè)鑒定方法的驗(yàn)證和應(yīng)用

將各口岸局送鑒的軟體動(dòng)物（表1）用TIANGEN組織基因組DNA提取試劑盒，按使用說(shuō)明書(shū)操作提取DNA，用設(shè)計(jì)的特異性引物HY（01）、HY（02）進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳、條帶鑒定，并與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果比對(duì)，來(lái)驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 花園蔥蝸牛的分布

花園蔥蝸牛主要分布中歐、北歐、冰島和北美地區(qū)。分布的國(guó)家包括英國(guó)、德國(guó)、法國(guó)、荷蘭、盧森堡、比利時(shí)、波蘭、瑞典、挪威、芬蘭和美國(guó)。在英國(guó)、德國(guó)、法國(guó)等歐洲國(guó)家是常見(jiàn)種［8－13］。

圖1 花園蔥蝸牛成螺貝殼形態(tài)特征

2.2 花園蔥蝸牛貝殼和卵的形態(tài)特征

花園蔥蝸牛成螺貝殼的主要鑒定特征為：貝殼扁球形，緩慢膨脹，有5～5.5個(gè)螺層，臍孔完全被唇緣覆蓋。口唇白色粗短（偶爾有褐色）。貝殼色彩明亮，有光澤，其上有微弱而不規(guī)則的生長(zhǎng)線和螺旋狀的色帶0～5條，故也稱白唇彩帶蝸牛。貝殼在顏色和色帶數(shù)量方面變異很大。口唇是褐色的個(gè)體，在形態(tài)上難以與森林蔥蝸牛相區(qū)別，一般來(lái)說(shuō)，花園蔥蝸牛貝殼更細(xì)薄一些，螺層更圓一些。殼高10～15mm，殼寬14～20mm（偶有22mm）［2，9－16］。

幼螺貝殼較小，殼質(zhì)薄，易碎，形態(tài)特征與成螺貝殼基本一致。

卵圓形，白色，直徑2mm 左右［2］。

2.3 花園蔥蝸牛的解剖特征

陰莖長(zhǎng)，陰莖本體與陰莖差不多等長(zhǎng)，陰莖本體略帶紫色。鞭狀體細(xì)長(zhǎng)。陰莖牽引肌薄而寬，中等長(zhǎng)度。授精囊柄長(zhǎng)，略粗。矢囊大，橢圓形，無(wú)副矢囊。黏液腺兩枝，分別在陰道兩側(cè)，每枝二分叉，分叉后每枝又分2～3枝，即一支黏液腺有4～6個(gè)分支；黏液腺管狀，粗實(shí)且長(zhǎng)，光滑。陰道呈紫色（圖2）。花園蔥蝸牛與森林蔥蝸牛生殖系統(tǒng)的區(qū)別在于：花園蔥蝸牛的黏液腺每枝有大于等于4個(gè)分支，而森林蔥蝸牛的黏液腺最多3個(gè)分支［2，13］；花園蔥蝸牛戀矢的橫切面是帶二分叉的刀片狀十字交叉，森林蔥蝸牛戀矢的橫切面是簡(jiǎn)單的刀片狀十字交叉（圖3）［12］。

2.4 花園蔥蝸牛COⅠ基因的PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定結(jié)果

花園蔥蝸牛COⅠ基因片段PCR產(chǎn)物大小為710bp，序列測(cè)定結(jié)果已登錄到NCBI上，登錄號(hào)為JQ235165。根據(jù)片段序列，用Primer 5和Oligo Demo 6軟件設(shè)計(jì)出引物若干對(duì)，經(jīng)過(guò)軟件分析及退火溫度試驗(yàn)，最終選擇花園蔥蝸牛的特異性引物為：

該對(duì)引物PCR產(chǎn)物的大小為453bp。

2.5 引物特異性擴(kuò)增結(jié)果

用引物 HY（01）、HY（02）經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增花園蔥蝸牛、森林蔥蝸牛、散大蝸牛、蓋罩大蝸牛、斯文豪大蝸牛、灰尖巴蝸牛，并設(shè)ddH2O為空白對(duì)照，只有花園蔥蝸牛擴(kuò)增出特異性片段，其他5種蝸牛和ddH2O對(duì)照均無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致（圖4），說(shuō)明該引物具有良好的特異性。

圖4 花園蔥蝸牛引物特異性擴(kuò)增結(jié)果

2.6 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的花園蔥蝸牛DNA濃度為232ng／μL，將模板DNA按104倍系列稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以ddH2O作為對(duì)照。結(jié)果顯示，在稀釋10－16倍后仍有微弱條帶，（圖5），說(shuō)明此方法具有很高的靈敏度。

圖5 花園蔥蝸牛PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 PCR檢測(cè)鑒定方法的驗(yàn)證與應(yīng)用

對(duì)各口岸局送鑒的軟體動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和PCR檢測(cè)方法比對(duì)。結(jié)果表明，形態(tài)學(xué)鑒定為花園蔥蝸牛的全部出現(xiàn)明亮的條帶，而形態(tài)學(xué)鑒定為其他種類(lèi)的蝸牛均無(wú)出現(xiàn)條帶，PCR檢測(cè)結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定相符合，表明此引物具有良好的特異性和穩(wěn)定性，所建立的PCR檢測(cè)方法可應(yīng)用于花園蔥蝸牛的實(shí)際檢測(cè)鑒定工作（表1）。

表1 PCR檢測(cè)方法與形態(tài)學(xué)鑒定的比對(duì)結(jié)果和實(shí)際應(yīng)用

3 結(jié)論和討論

目前，對(duì)花園蔥蝸牛的鑒定主要是依據(jù)貝殼特征，而它的貝殼與同屬的森林蔥蝸牛極為相似，尤其是口唇為褐色的花園蔥蝸牛個(gè)體，確實(shí)與森林蔥蝸牛很難鑒別，即使是訓(xùn)練有素的陸生軟體動(dòng)物分類(lèi)專家，也必須通過(guò)解剖軟體的生殖系統(tǒng)才能鑒別。然而，迄今為止國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)院校植物保護(hù)系既沒(méi)有開(kāi)設(shè)軟體動(dòng)物分類(lèi)學(xué)專業(yè)課程，也沒(méi)有專門(mén)的師資和研究力量，而目前口岸檢疫工作主要是由植物保護(hù)專業(yè)的科技人員承擔(dān)軟體動(dòng)物的檢疫鑒定，造成了實(shí)際檢疫鑒定工作的被動(dòng)。近年來(lái)，PCR檢測(cè)鑒定技術(shù)在國(guó)境口岸部門(mén)已相當(dāng)普及，本文所建立的PCR方法為檢測(cè)鑒定花園蔥蝸牛提供了新的技術(shù)和方法，也為非軟體動(dòng)物分類(lèi)專業(yè)的檢疫人員提供了快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

本研究所設(shè)計(jì)的特異性引物HY（01）、HY（02）對(duì)花園蔥蝸牛DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的條帶，并且與森林蔥蝸牛、散大蝸牛、蓋罩大蝸牛、斯文豪大蝸牛和灰尖巴蝸牛進(jìn)行對(duì)照，均無(wú)條帶出現(xiàn)，建立了花園蔥蝸牛的PCR檢測(cè)鑒定方法，并在實(shí)際檢疫工作中得到驗(yàn)證和應(yīng)用。試驗(yàn)和應(yīng)用表明，該方法特異、敏感、穩(wěn)定。在實(shí)際檢疫過(guò)程中，分類(lèi)專家可根據(jù)貝殼形態(tài)進(jìn)行初步鑒定，然后用PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)；對(duì)于非軟體動(dòng)物分類(lèi)專業(yè)的科技人員，則可先用PCR方法進(jìn)行初篩，確認(rèn)為花園蔥蝸牛的疑似種，再送分類(lèi)專家進(jìn)行最后確認(rèn)，可確保鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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Morphology and PCR identification technology ofCepaeahortensis

Xiao Qiong1，2， Yang Haifang3， Ai Hongmu1， Zhou Weichuan2
（1.CollegeofPlantProtection，F(xiàn)ujianAgriculturalandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou350002，China；2.StateKeyLaboratoryofMolluscanQuarantineandIdentification，F(xiàn)ujian Entry－ExitInspection＆QuarantineBureau，F(xiàn)uzhou350001，China；3.NationalWetlandMuseumofChina，Hangzhou310013，China）

CepaeahortensisMüller is one of the species in the import plant quarantine pest list.This species is difficult to be distinguished from similar species by the shell characters.In this study，the shell characters，anatomical method and PCR were used to identifyC.hortensis.The results showed that PCR method had high specificity，sensitivity and stability，and it could provide a quick and easy technical method for identification ofC.hortensis.

Cepaeahortensis； plant quarantine； PCR； identification

S 41

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.022

2011－11－11

2011－12－07

福建省國(guó)際重點(diǎn)項(xiàng)目（201210001）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J01063）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31040072）

＊ 通信作者E－mail：wczhou＠163.com