膠體金免疫層析法快速檢測牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留

文 / 萬宇平 趙正苗 田 甜 汪善良 韓京朋

（北京勤邦生物技術有限公司）

氟喹諾酮（Fluoroquinolones，FQs）類藥物是一系列新型氟取代的喹諾酮類衍生物[1]。FQs又稱吡啶酮酸類藥物，屬于化學合成抗菌藥。該類藥物對葡萄球菌、肺炎球菌、某些厭氧菌、支原體等均有效，特別是對綠膿桿菌效果好，幾乎適用于臨床常見的各種細菌感染性疾病[2，3]。喹諾酮類藥物的作用機制是抑制細菌的DNA旋轉酶，從而影響DNA的正常形態與功能，阻礙DNA的正常復制、轉錄、轉運與重組，從而產生快速殺菌作用[4]。

FQs長期使用會蓄集到動物體內，從而影響人類的飲食衛生與食品安全。隨著FQs的廣泛使用，細菌耐藥和不良反應也相繼發生，主要有過敏、溢血和腎衰等不良反應。此外還有誘發精神病及癲癇患者發病的風險[5，6]。

由于牛奶中的抗生素會影響牛奶的進一步加工，因此許多國家，以及聯合國糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）等國際機構都作出規定：奶牛在接受抗生素治療期間及用藥后數日內擠出的乳汁不得用于生產商品乳[7]。盡管如此，仍有不少農場或奶農不顧抗生素的危害，不遵守相關規定，向乳品加工企業提供含有抗生素的原奶。因此，對乳品加工企業來說，抗生素已經是原奶收購環節必不可少的檢測項目。膠體金免疫層析技術是20世紀80年代發展起來的一項新技術，具有簡便、快速、準確、費用低的特點[8]。本研究以獸醫臨床上應用較廣的FQs作為檢測的目標藥物，利用膠體金免疫層析方法實現了牛奶中多種FQs殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

氯金酸（HAuCl4.4H2O）（分析純，上海化學試劑有限公司）；恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、依諾沙星、培氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、達氟沙星、三聚氰胺、磺胺甲氧異惡唑、氯霉素、紅霉素、慶大霉素、四環素標準品、牛血清白蛋白（BSA）、羊抗鼠二抗（Sigma）；硝酸纖維素膜、吸收墊、樣品墊、PVC底板（上海金標生物科技有限公司）；包被抗原（FQs-OVA）、恩諾沙星單抗（自制）；牛奶（市售）；其它試劑均為國產分析純試劑。

電子天平FA2104（上海良平儀器儀表有限公司）；磁力攪拌器90-2（上海振榮科學儀器有限公司）；低速離心機L500（湘儀集團）；數控切條機CT300、連續式劃膜儀HM8000（上海金標生物科技有限公司）；分光光度計752S（上海棱光技術有限公司）；生化培養箱DHP-600（天津市中環實驗電爐有限公司）；LGJ-50C凍干機（北京四環科學儀器廠有限公司）；Milli-Q Reference純水儀（美國Millipore）；液相色譜-串聯質譜系統（日本島津）。

1.2 膠體金的制備

用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%（質量百分含量），置磁力加熱棒攪拌器上攪拌煮沸，每100 mL的0.01%氯金酸加入2.5 mL的1%檸檬酸三鈉，繼續攪拌加熱反應至液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室溫后補足失水[9]。

1.3 金標抗體制備

在磁力攪拌下，用0.2 mol/L碳酸鉀調膠體金的pH值至7.0，抗體按50～100 μg/mL膠體金的標準向膠體金溶液中加入上述FQs單克隆抗體。繼續攪拌混勻30 min， 加入10%BSA，至BSA在膠體金溶液中的終濃度為1%（體積百分含量），靜置30 min。12000 rpm，4 ℃離心30 min，棄上清液，沉淀用復溶緩沖液洗滌2次，用體積為初始膠體金體積1/20的復溶緩沖液將沉淀重懸，得到的FQs單克隆抗體-膠體金標記物溶液的濃度為50 μg/mL，置4 ℃備用。

1.4 微孔試劑制備

向微孔試劑微孔板中加入100 μL FQs單克隆抗體-膠體金標記物，放入冷凍干燥機中，冷阱溫度為-70 ℃的條件下，預凍4 h后，再凍干14 h，即可取出，得到凍干有FQs單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑。

1.5 試紙條組裝

用0.01 mol/L，pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液將FQs-OVA偶聯物稀釋到1 mg/mL，用Isoflow點膜儀將其包被于NC膜上的檢測線（T線），包被量為1 μL/cm；在距離檢測線3 mm處用pH值7.2，0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠二抗稀釋到1 mg/mL，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質控線（C線），包被量為1 μL/cm。包被完畢后將包被好的NC膜置于37 ℃烘干60 min，取出。將樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜依次按順序粘貼在所述底板上，樣品吸收墊的末端與反應膜始端相連，反應膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，試紙兩端粘貼有保護膜，手柄端保護膜覆蓋在吸水墊上手柄端，反應端保護膜覆蓋在樣品吸收墊的檢測端，在檢測端保護膜上印有MAX標記線，用數控切條機CT300切割成4 mm寬的試紙條（圖1）。

1.6 免疫層析檢測步驟

1.6.1 使用前將本試劑條和待檢奶樣恢復至室溫（牛奶樣品必須為均勻液體，不能有結塊和沉淀）。

1.6.2 從原包裝中取出試劑桶，打開后取出所需數目的微孔試劑和試紙條，并做好標記（需在1 h內使用）。檢測試劑取出后，需立即蓋好試劑桶蓋。

1.6.3 吸取待檢牛奶樣品溶液，用微量移液器移取200 μL于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻。

1.6.4 將標記好的試紙條插入微孔中，印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中。

1.6.5 室溫（20～25 ℃）孵育5 min后，取出試紙條，判定結果。

圖1 試紙條組裝模式圖

圖2 檢測結果判斷

1.7 檢測結果分析

FQs在樣品中的含量高于等于試劑條對其最低檢測限時，FQs單克隆-膠體金標記物與FQs結合，金標抗體上的抗原結合位點被封閉，從而在檢測區內因為競爭反應，不會與FQs-載體蛋白偶聯物結合而不出現紅色條帶。陰性樣品在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應，將會在檢測線和質控線上出現紅色條帶（圖2）。具體如下：

陽性：當質控線（C）顯示一條紅色條帶，而檢測線（T）不顯色，判為陽性；

陰性：當質控線（C）顯示一條紅色條帶，檢測線（T）同時也顯示出一條紅色條帶，且檢測線（T）顏色接近或淺于質控線（C）時，判為陰性；

無效：當質控線（C）不顯示出紅色條帶，則無論檢測線（T）顯示出紅色條帶與否，該試紙條判為無效。

1.8 檢測限試驗

取陰性牛奶樣品，分別添加質量濃度為0、10、20、40 μg/L的恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達氟沙星標準品和0、20、40、80 μg/L的依諾沙星、惡喹酸標準品。所用的稀釋液為pH值為7.2，0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液。向微孔試劑中滴加200 μL配制好的標準品，混勻，孵育5 min后，將試紙插入檢測。

1.9 方法特異性

特異性常用交叉反應率表示，是指抗體與結構不同的抗原決定簇發生結合的能力。將牛奶中常檢的其它藥物：三聚氰胺、磺胺甲氧異惡唑、氯霉素、紅霉素、慶大霉素、四環素按照500 μg/L的質量濃度分別對陰性牛奶進行添加。用試紙條進行檢測，每個濃度重復3 次，判斷試紙條的特異性。

1.10 試紙條與液相色譜檢測比對[10]

1.10.1 液相色譜條件

色譜柱：Inertsil C5-3，5 μm，150 mm ×2.1 mm（內徑）或相當者；流動相：0.1%甲酸的乙腈溶液+0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫（梯度時間表見表1）；流速：300 μL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：30 μL。

1.10.2 質譜條件

離子化模式：電噴霧電離正離子模式；質譜掃描方式：多反應監測；分辨率：單位分辨率。

1.11 重復性試驗

取陰性牛奶樣品2 份，分別添加質量濃度為0、20 μg/L的恩諾沙星，將添加的牛奶各用10 支試紙條進行重復檢測，觀察檢測結果是否一致。

1.12 穩定性試驗

穩定性試驗分為37 ℃加速試驗和4 ℃保存試驗，將制備好的試紙條置于37 ℃進行加速試驗，分別在7、14、28、56、112 天取出進行檢測，每次3組，每組10 個平行，分別以質量濃度為0、10、20 μg/L的恩諾沙星標準品添加的陰性牛奶進行檢測，觀察顏色的變化。將制備好的試紙條置于4 ℃下進行試驗，分別在1、3、6、9、12、15 個月取出進行檢測，每次3 組，每組10 個平行，以質量濃度為0、10、20 μg/L的恩諾沙星標準品添加的陰性牛奶進行檢測，觀察顏色的變化。

表1 梯度洗脫條件

圖3 紫外掃描膠體金結果

圖4 膠體金與待標記蛋白質比例確定

圖5 微孔試劑示意圖

2 結果與分析

2.1 膠體金質量鑒定結果

制備好的膠體金外觀純凈、透亮，無沉淀和漂浮物。將膠體金溶液用紫外/可見光分光光度計在可見光范圍（400～600 nm）掃描，得到單一的吸收峰，最大吸收峰波長為525 nm（圖3）。

2.2 金標抗體和微孔試劑

膠體金是一種帶負電荷的疏水性顆粒，未加抗體或加入的抗體量不足以穩定膠體金時，由于鹽離子效益，加入氯化鈉時，會改變膠體金的性質，出現由紅變藍的聚沉現象（圖4）；反之，加入足夠多抗體足以穩定膠體金，則不會發生聚沉現象。以目測法確定膠體金與待標記蛋白質用量比例，制備金標抗體，并加入微孔板中，通過冷阱凍干，制備微孔試劑（圖5）。

2.3 檢測限

結果顯示：添加0、10 μg/L的恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達氟沙星和0、20 μg/L的依諾沙星、惡喹酸的牛奶，試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色條線，呈陰性；添加20、40 μg/L的恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達氟沙星和40、80 μg/L的依諾沙星、惡喹酸的牛奶，試紙條質控區顯色，但檢測區不顯色，呈陽性。

因此，可以認為，本試劑條對恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達氟沙星檢測檢測限為20 μg/L，對依諾沙星、惡喹酸檢測檢測限為40 μg/L。

2.4 特異性

結果顯示：三聚氰胺、磺胺類藥物、氯霉素、大環內酯類藥物、氨基糖苷類藥物、四環素類藥物在500 μg/L濃度時，試紙條質控區和檢測區均顯色，可以得出本試劑條未對這些藥物發生交叉反應。

表2 試紙條檢測結果與儀器方法檢測結果比較 單位：μg/L

表3 37 ℃加速試驗結果

表4 4℃保存試驗結果

2.5 液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS）法比對結果

抽取陰性牛奶樣品20份，隨機抽取5份，添加質量濃度為20 μg/L的恩諾沙星，分別用本試紙條方法和儀器方法檢測，結果見表2。結果顯示，試紙條的檢測結果與儀器檢測結果一致，氟喹諾酮類藥物殘留檢測試紙條的檢測結果穩定可靠。

2.6 重復性試驗

將添加濃度為0μg/L的牛奶用試紙條重復檢測發現，試紙條的檢測線均顯色，且深淺大致一致，而添加濃度為20μg/L的牛奶，檢測線均未顯色。試紙條對牛奶樣品檢測的假陽性率和假陰性率均為0，表明本試驗制得的試紙條重復性較好。

2.7 穩定性試驗

穩定性決定試紙條的有效期限。為了檢測試紙條的穩定性，分別進行37 ℃加速試驗和4 ℃保存試驗，其中37 ℃加速試驗結果如表3所示，4℃保存試驗結果如表4所示。結果表明，氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙條在4 ℃條件下可以保存12 個月。

3 結論

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，通過肉眼觀察以及紫外掃描，確定所制備的膠體金顆粒均一，平均直徑為40 nm。以膠體金標記抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體，建立膠體金免疫層析法快速檢測氟喹諾酮類藥物殘留方法，試紙條對牛奶中恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達氟沙星檢測檢測限為20 μg/L，對依諾沙星、惡喹酸檢測檢測限為40 μg/L，可用于牛奶中11 種氟喹諾酮類藥物殘留檢測。該方法能夠滿足日本、歐盟、加拿大和美國對氟喹諾酮類藥物在牛奶中最高殘留限量檢測的要求[11，12]。試紙條檢測線顏色明顯淺于空白對照，通過目測即可直接判定結果。該方法具有樣品前處理方法簡便，檢測時間短，靈敏度高的特點，而且與其它藥物無交叉反應，特異性良好，假陽性率和假陰性率均為0。經LC-MS/MS法驗證，試紙條檢測結果穩定可靠。另外，該方法所用試劑均無毒、無污染，可用作牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留檢測的快速定性篩選，但對于陽性結果需用其它方法進一步確認。

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