氮肥用量對藥用菊花生長及其藥用品質的影響

劉大會，朱端衛，郭蘭萍，劉 偉，左智天，金 航，楊 雁

(1華中農業大學資源與環境學院，湖北武漢430070;2云南省農業科學院藥用植物研究所，云南昆明650231;3中國中醫科學院中藥研究所，北京100700)

菊花為菊科植物菊(Chrysanthemum morifoliumRamat．)的干燥頭狀花序，是我國傳統常用大宗中藥材，其主要成分為綠原酸、黃酮、糖、氨基酸及礦質元素等，具有散風清熱、平肝明目、清熱解毒的功效，且還為藥食同源的物品，被廣泛用于保健茶飲和食品。綠原酸和黃酮等酚類物質是植物體莽草酸代謝途徑生成的次生代謝產物，其對提高植物體自身保護和生存競爭能力起著重要的作用［1－3］，光照、臭氧、溫度、水分脅迫和傷害等多種環境因素的刺激都會誘導植物產生酚類物質［4－6］。在藥菊次生代謝過程中，植株體內的苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的催化下解氨生成反式肉桂酸，是生成黃酮和綠原酸等次生物質的莽草酸代謝途徑的第一步反應，即關鍵反應步驟，這一過程對菊花藥用品質舉足輕重。近年來，施用氮肥對植物中酚類成分合成代謝的調控也日益受到人們的關注［7－9］。施用氮肥對藥用菊花生長、產量和養分累積等也有顯著影響［10－11］，但關于氮肥用量對藥菊綠原酸、黃酮、可溶性糖和氨基酸等活性成分及其植株相關生理指標影響的研究報道較少。為此，本文采用盆栽試驗方法，研究了氮肥用量對藥用菊花活性成分累積及其葉綠素含量、PAL活性和礦質元素含量的影響及其作用機理，以期為藥菊規范化栽培的合理施氮提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2005年6月至12月在華中農業大學微量元素研究中心盆栽試驗場進行。供試藥菊種苗引自湖北麻城市福田河鎮藥菊種植基地，栽培品種為福田河白菊(杭菊)，適合在微酸性土壤上種植。為確保肥效區分，供試土壤采自武漢獅子山黃棕壤的底土，基本理化性狀為：pH 5.92、有機質含量0.26%、堿解氮21.4 mg/kg、速效磷2.6 mg/kg、速效鉀60.7 mg/kg。

盆栽試驗每盆裝土10.0 kg(適當添加石英砂，以改善通氣狀況)，設置5個氮肥用量，分別為N 0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 g/kg 土，分別用 N1、N2、N3、N4和 N5表示，以硫酸銨作肥源，各處理氮肥分3次施入，底施1/2，剩余氮肥平均分成兩份，分別于8月16日和9月20日追施;各處理均基施P2O50.20 g/kg土和 K2O 0.30 g/kg土，以 Ca(H2PO4)2、K2SO4作肥源;另每盆基施10 g白云石以調節土壤pH值和補充鈣、鎂營養;同時，每盆基施10 mL阿農微量元素混合液以補充土壤微量營養元素。每處理4次重復，每盆定植1株藥菊扦插苗，定植時間為6月15日，按照常規進行管理。菊花采收期為當年11月1日～12月15日。

1.2 測定項目及方法

采用SPAD-502葉綠素計測定藥菊葉片葉綠素含量。在藥菊生長期，每隔一段時間在植株上隨機抽取6片上部葉片(每個枝條從上向下數第5～6片葉)測定其葉綠素值，取平均值作為植株葉綠素相對含量。

參照 Lister等［12］和李合生［13］的方法測定花、葉樣品的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性。分別于11月5日、11月17日和12月3日分三次，從各處理植株枝條頂部上隨機采取8朵花瓣微開的鮮花，以及植株枝條上部的第3、4片葉，用于測定花及葉片中的PAL活性。

在藥菊蕾期調查植株的分枝數和株高;在花期，當花朵的舌狀花全白、管狀花50%左右展開時開始采樣，并按照菊花質量先后采收一水花(11月15日以前采收，對應早期)、二水花(11月15～25日采收，對應中期)和三水花(11月25日以后采收，對應末期)。在稱量鮮花產量后及時將花用微波殺青，于55℃以下烘至全干稱重。將制備好的菊花粉碎制樣，過篩，保存待測。采用 HPLC法測定綠原酸［14］，鋁鹽比色法測定總黃酮［14］，用蒽酮比色法測定可溶性總糖，用茚三酮比色法測定可溶性總氨基酸。

將活性成分的含量乘以各期花干物質量并累加得到活性成分的累積量。

試驗數據采用 Microsoft Excel(2003)和SAS9.0統計軟件進行統計分析，LSD法檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 氮肥用量對藥菊植株生長和菊花產量的影響

氮肥用量較低時(N1～N3)，藥菊生長發育遲緩，植株低矮，分枝少;氮肥用量增加，植株株高和分枝數大幅增加，見表1。一水花、二水花和總產的鮮花產量同氮肥用量成正比，但隨著氮肥用量增加，各期花鮮花產量的增幅即氮肥增產效率將逐漸減小。一水花、二水花和總產的鮮花折干率是隨著氮肥用量的增加呈逐步降低趨勢，而三水花除N1處理鮮花折干率略低外，其他施氮處理間差異不顯著。

表1 氮肥用量對藥菊生長和菊花產量的影響Table 1 Effects of N application rates on the growth of C．morifolium and the yield of flowers

氮肥用量也顯著影響不同采收期鮮花產量占總產量的比例。N1和N2處理一水花產量占總產量的比例分別為0和25%，隨著氮肥用量的增加，高氮處理一水花的比例逐步增加到54%(N5處理);而二水花的比例由N1處理的57%降至N5處理的31%，三水花的比例由N1處理的44%逐步降至N5處理的16%。上述結果表明，施用氮肥可明顯提前藥菊植株的開花期，而缺氮會導致藥菊開花期推遲。將藥菊植株全生育期鮮花總產量(Y)同氮肥用量(X)進行回歸分析，可得一元二次多項式模型：Y= －19.40+2214.98X －2184.76X2(n=20，r=0.994 9＊＊)，當氮肥用量為N 0.5069 g/kg土時，其鮮花總產量最高為542.01 g/株。

2.2 氮肥用量對藥菊葉片葉綠素含量的影響

從表2可知，低氮肥用量處理(N1、N2)植株葉片中(SPAD值)較低，隨著氮肥用量的提高，植株葉片中葉綠素含量(SPAD值)逐步上升。不同生育期相比，各處理葉綠素含量在生育前期較高(9月16日以前)，隨著生長發育的進行，葉綠素的含量將逐步降低;其中，低、中氮肥用量處理(N1、N2、N3)葉綠素含量(SPAD值)較生育前期分別下降了57%、59%和42%，而高氮肥用量處理(N4、N5)僅下降了30%和18%。上述結果表明，缺氮會影響藥菊植株葉片的葉綠素含量，從而影響植株的生長。

表2 氮肥用量對藥菊葉片葉綠素含量(SPAD值)的影響Table 2 Effects of N application rates on leaf chlorophyll content(SPAD value)of C．morifolium

2.3 氮肥用量對藥菊葉片和花中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響

從表3可知，藥菊葉片和花中的PAL活性同氮肥用量成反比，低氮肥用量處理(N1、N2)葉片和花中PAL活性高，且兩處理差異不顯著。隨著氮肥用量提高，藥菊葉片和花中的 PAL活性大幅度降低，三個時期的N5處理葉片中的PAL活性較N1處理下降了39% ～52%，花中下降了22%和40%，這表明施用氮肥會降低藥菊植株的PAL活性，從而對莽草酸次生代謝途徑產生一定的抑制作用。藥菊葉片中的PAL活性在采收期內變化不大，而花中的PAL活性則是隨著采收期的推進呈降低趨勢。另外，葉片中的PAL活性則顯著高于花，說明葉片是莽草酸次生代謝途徑的主體。

表3 氮肥用量對藥菊葉片和花中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響Table 3 Effects of N application rates on PAL activity in leaves and flowers of C．morifolium

2.4 氮肥用量對藥菊花中礦質元素含量及其比例的影響

由表4可見，菊花中各礦質元素含量大小順序為鉀(K)＞氮(N)＞鈣(Ca)＞磷(P)。氮肥用量對花中礦質元素含量及其比例也有顯著影響。隨著氮肥用量的提高，不同花期花中氮元素含量逐步提高;而花中磷、鉀、鈣含量則同氮肥用量或花中氮含量成反比。不同處理花中鉀含量隨著采收期的推進呈逐步降低趨勢，磷含量在生育期內變化不大;氮、鈣含量是中、低氮處理生育期內變化不大;而高氮處理(N5)則呈逐步降低的趨勢。另外，隨著氮肥用量的提高，不同花期花中N/P、N/K和N/Ca均逐步升高。各處理花中N/K隨采收期的推進呈逐步增加趨勢，而N/P和N/Ca是先降后升趨勢。

2.5 氮肥用量對菊花活性成分含量與累積量的影響

從表5可知，菊花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量同氮肥用量成反比，且氮肥用量越大，降低的幅度也越大，高氮處理(N5)不同花期上述三成分含量的下降幅度分別為35% ～45%、29% ～36%和6%～10%。這一結果表明，施用氮肥會抑制藥菊植株酚類物質的合成代謝，并顯著降低菊花中綠原酸和總黃酮的含量。與之相反，花中可溶性氨基酸含量同氮肥用量成正比，即隨著氮肥用量的提高，不同花期花中可溶性氨基酸含量逐漸增加。另外，菊花中綠原酸和總黃酮含量隨著采收期推進逐漸降低，而可溶性糖和可溶性氨基酸含量則逐漸升高。

菊花中綠原酸、總黃酮、可溶性糖和可溶性氨基酸的累積總量同氮肥用量成正比，但隨氮肥用量增加，花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖累積總量的增幅逐漸降低，而可溶性氨基酸增幅則呈增加趨勢。將藥菊花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖的累積總量(Y)同氮肥用量(X)進行回歸分析，可分別得一元二次多項式模型：Y綠原酸=0.02+1.83X－1.99X2(n=20，r=0.9875＊＊)，Y總黃酮=0.21+35.77X －42.79X2(n=20，r= 0.9934＊＊) 和 Y可溶性糖=－0.08 + 121.01X －132.18X2(n=20，r=0.9903＊＊);當氮肥用量分別為 0.4598、0.4180 和0.4577 g/kg時，其花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖的累積總量最高，可分別為0.44、7.69和27.62 g/株。

表4 氮肥用量對菊花中氮、磷、鉀和鈣含量及其比例的影響Table 4 Effects of N application rates on the contents of N，P，K and Ca and the ratio of N/P，N/K and N/Ca in flowers of C．morifolium

表5 氮肥用量對菊花中綠原酸、總黃酮、可溶性糖和氨基酸含量的影響Table 5 Effects of N application rates on the contents of chlorogenic acid，total flavonoids，and soluble sugar and amino acid in flowers of C．morifolium

將二水花中各生理指標、礦質元素含量、活性成分含量及葉面有關指標進行相關分析，結果見表6。其中，花中氮含量及N/P、N/K和N/Ca同花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量及葉片和花中的PAL活性之間呈極顯著負相關，同花中可溶性氨基酸含量和葉片的葉綠素含量呈極顯著正相關;磷、鉀和鈣含量同花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量及葉片和花中的PAL活性之間呈顯著或極顯著正相關，同花中可溶性氨基酸含量和葉片SPAD值呈極顯著負相關。葉片的葉綠素含量同花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量及葉片和花中的PAL活性之間呈極顯著負相關，同花中可溶性氨基酸含量呈極顯著正相關;葉片和花中的PAL活性同花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量之間呈極顯著正相關，同花中可溶性氨基酸含量呈極顯著負相關。另外，花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量三者之間互呈極顯著正相關，而三者同花中可溶性氨基酸含量之間均呈極顯著負相關。其他兩期花的相關分析結果同二水花期的研究結果也是一致的。

3 討論與結論

本研究表明，菊花為喜氮植物，氮肥對藥菊植株生長和菊花產量有著顯著的促進作用。施用氮肥促進植株對氮的吸收，植株葉綠素含量也大幅增加，從而促進其光合作用和干物質的積累，并顯著促進植株花芽分化，增加藥材產量和外觀品質。但隨著氮肥用量的增加和菊花中氮含量逐步增高，花中磷、鉀和鈣含量降低，N/P、N/K和N/Ca比上升，從而導致植株中礦質元素間比例失調，因而氮肥的增產效率和單位氮肥用量報酬率將逐步減小直至不再增產，這同祝麗香等［11］在杭白菊上的研究結果是一致的。

綠原酸和黃酮均為植物中莽草酸代謝途徑生成的次生代謝產物，是通過氮代謝產物苯丙氨酸在PAL的催化下解氨進入莽草酸代謝途徑而生成，這一過程同植物體內合成蛋白質存在著競爭關系［15］，故氮肥用量過高將大幅降低菊花中綠原酸和總黃酮的含量，花中氮含量以及N/P、N/K和N/Ca與其綠原酸和總黃酮含量呈顯著負相關也是該過程的表現。

同化產物糖是植物體內黃酮類成分次生合成代謝的起始物質，且天然黃酮類化合物多以苷類形式存在，故糖對植物體內黃酮類成分的合成代謝影響比較大。根據碳素/營養平衡假說［16］：礦質營養脅迫(包括缺乏和毒害)時，植物生長的速率大大降低，而光合速率保持相對穩定，這樣植物會積累較多的碳水化合物，體內碳素/營養比增大，以碳素為基礎的次生代謝物質(如黃酮等酚類物質)就會增加。生長/分化平衡假說也認為［17］，任何對植物生長與光合作用有不同程度影響的環境因子，都會導致次生代謝物質的變化，對植物生長抑制作用更強的因素將增加次生代謝產物。Singh等［18］發現，當植株氮素供應不足時，由于植物體對氮再利用能力較強，植物體內合成的苯丙氨酸將在PAL作用下解氨，釋放的NH4+會經谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(GS/GOGAT)途徑重新回到植物體內的氮循環過程，從而使植物體內有限的氮再循環利用，這一過程也有利于黃酮類次生代謝物的生成。前人研究也證明，高氮降低蘋果葉片中總黃酮含量的機制在于使葉片PAL的活性降低［19］，高氮營養條件下會促進蕎麥中苯丙氨酸合成蛋白質，從而抑制黃酮類化合物的合成［20］。本研究中低氮肥用量條件下，藥菊植株氮素不足，這促使其體內大部分苯丙氨酸解氨生成綠原酸和黃酮等酚類物質，并將解脫下來的氨繼續用于植株體內的氮代謝。但在高氮條件下，藥菊植株氮素充足，抑制了其體內綠原酸和黃酮成分的合成，從而促進苯丙氨酸轉化成蛋白質。

菊花中可溶性糖和可溶性氨基酸含量隨著采收期的推進而增加，花中綠原酸和總黃酮含量是隨著采收期的推進而降低，這與郭巧生等［21］的研究結果是一致的，其原因可能是采收期外界環境溫度逐步降低、晝夜溫差加大，低溫導致植株多糖和蛋白質等大分子物質分解為可溶性糖和可溶性氨基酸等小分子物質從而提高植株抗寒性有關。菊花中綠原酸和總黃酮含量是隨著采收期的推進而降低，這與郭巧生等［21］的研究結果也是一致的，其原因可能與菊花采摘部位變化、花中PAL活性降低和次生代謝產物的前體底物降少等因素有關。

在藥用菊花生產上，應注意合理施用氮肥。綜合比較氮肥用量對菊花藥材產量、外觀品質、活性成分含量與累積量等因素的影響，建議菊花生育期內氮肥用量在0.30～0.40 g/kg為適宜。關于氮肥品種和氮肥運籌對菊花生長及其藥用品質的影響，以及不同氮肥用量條件下菊花植株各礦質元素的吸收和分配規律，還有待進一步研究。

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［1］Stafford H A．Flavonoids metabolism［M］．Boca Raton，FL：CRC Press，1990.101 －132.

［2］Nugroho L H，Verberne M C，Verpoorte R．Activities of enzymes involved in the phenylpropanoid pathway in constitutively salicylic acid-producing tobacco plants ［J］．Plant Physiol．Biochem．，2002，40：755－760.

［3］Schijlen E G W M，de vos C H R，van Tunen A J，Bory A G．Modification of flavonoid biosynthesis in crop plants［J］．Phytochemistry，2004，65：2631－2648.

［4］Lancaster J E．Regulation of skin color in apples［J］．Crit．Rev．Plant Sci．，1992，10：487 －502.

［5］Kangasjarvi J，Talvinen J，Utriainen M，Karjalainen R．Plant defence systems induced by ozone ［J］．Plant Cell Environ．，1994，17：783－794.

［6］Matern U，Grimmig B．Natural phenols as stress metalites［J］．Acta Hortic．，1994.381：448 －462.

［7］Bongue-Bartelsman M，Phillips D A．Nitrogen stress regulates gene expression of enzymes in the flavonoid biosynthetic pathway of tomato［J］．Plant Physiol．Biochem．，1995，33：539 －546.

［8］Patil B S，Alva A K．Enhancing citrus nutraceuticals through variable nutrient rates［J］．Hort Science，1999，34：520.

［9］Awad M A，de Jager A．Relationship between fruit nutrients and concentrations of flavonoids and chlorogenic acid in‘Elstar’apple skin［J］．Sci．Hortic．，2002，92：265 －276.

［10］劉大會，朱端衛，周文兵，等．氮、磷、鉀配合施用對福田白菊產量和品質的影響［J］．中草藥，2006，37(1)：125－129.

Liu D H，Zhu D W，Zhou W Bet al．Effect of nitrogen，phosphorus and potassium on yield and quality of Futian，sChrysanthemum morifolium［J］．Chin．Trad．Herb．Drugs，2006，37(1)：125－129.

［11］祝麗香，王建華，畢建杰，等．不同氮肥用量對杭白菊養分積累、轉運及產量的影響［J］．植物營養與肥料學報，2010，16(4)：992－997.

Zhu L X，Wang J H，Bi J Jet al．Effect of N application rates on nutrients accumulation，transformation and yield ofChrysanthemum morifolium［J］．Plant Nutr．Fert．Sci．，2010，16(4)：992－997.

［12］Lister C E，Lancaster J E，Walder J R L．Developmental changes in enzymes of flavonoids biosynthesis in the skins of red and green apple cultivars［J］．J．Sci．Food Agric．，1996，71：313－320.

［13］李合生．植物生理生化實驗原理和技術［M］．北京：高等教育出版社，2000．186.

Li H S．Principles and technique plant physiological biochemical experiment［M］．Beijing：Higher Education Press，2000.186.

［14］劉大會，楊特武，朱端衛，等．不同鉀肥用量對福田河白菊產量和質量的影響［J］．中草藥，2007，38(1)：120－124.

Liu D H，Yang T W，Zhu D Wet al．Effect of potassium application at various rates on yield and quality of flower inChrysanthemum morifoliumfrom Futianhe region［J］．Chin．Trad．Herb．Drugs，2007，38(1)：120－124.

［15］Faust M．Physiology of anthyocyanin development in McIntosh apple．Ⅱ．Relationship between protein synthesis and anthyocyanin development［J］．J．Am．Soc．Hortic．Sci．，1965，87：10－20.

［16］Bryant J P，Chapin F S III，Klein D R．Carbon/nutrient balance of boreal plants in relation to vertebrate herbivory ［J］．Oikos，1983，40：357－368.

［17］Wareing P F，Phillips I D J．Growth and differentiation in plants(3rded．) ［M］．Oxford：Pergamon Press，1981.133.

［18］Singh S，Lewis N G，Towers G H N．Nitrogen recycling during phenylpropanoid metabolism in sweet potato tubers［J］．J．Plant Physiol．，1998，153：316 －323.

［19］Strissel T，Halbwirth H，Hoyer U et a1.Growth-promoting nitrogen nutrition affects flavonoid biosynthesis in young apple(Malus domesticaBorkh．)leaves［J］．Plant Biol．，2005，7(6)：677－685.

［20］Margna U，Margna E，Vainjarv T．Influence of nitrogen on the utilization of L-phenylalanine for building flavonoids in buckwheat seedling tissues［J］．J．Plant Physiol．，1989，134：697 －702.

［21］郭巧生，張志遠，周黎君，等．藥用白菊花主要生理特性及其與活性成分相關分析［J］．中國中藥雜志，2010，35(7)：825－829.

Guo Q S，Zhang Z Y，Zhou L Jet al．Correlation of main physiological characteristics and active componentsin cultivars of medicinalChrysanthemum morifolium［J］．China J．Chin．Material med．，2010，35(7)：825 －829.