田菁莖瘤固氮根瘤菌對小麥種子侵染的促生作用及其在根系內的定殖

劉華偉，孫 超，楊 呼，林曉軍，郭藹光*

(1西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌712100;2旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌712100)

目前，在我國過度使用化肥以及由此引發的一系列環境等問題已引起了國內外普遍關注［1－3］。如果主要農作物能夠實現生物固氮，減少對化肥的依賴，既節省能源，又保護環境，對農業的可持續發展將具有里程碑意義，對人類健康具有長遠的重大影響［4］。

固氮菌除自生固氮、共生固氮外，還存在第三種生活形式：與非豆科草本植物(水稻、小麥、玉米、高粱、油菜等)聯合固氮(Associative Symbiotic Nitrogen Fixation)［5］。固氮菌能定殖于根表面或近根處土壤，部分還能定殖于植物組織內部，與宿主有密切聯系但又不與其形成特化結構。聯合固氮，可減少非豆科草本植物氮肥使用量，有利于降低農業生產成本，減輕化肥污染，保護生態環境。聯合固氮菌還作為植物促生菌(Plant Growth Promoting Bacteria，PGPB)，會分泌吲哚乙酸(IAA)等激素，可促進植物生長，增加產量，并對植物不造成病害，為非豆科草本植物尤其是禾本科作物的生物固氮拓寬了領域［6］。

田菁莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans，A．caulinodans)ORS571，能通過裂隙侵染方式誘導豆科植物毛萼田菁(Sesbania rostrata)根與莖結瘤固氮。由于其對氧濃度的要求較其他根瘤菌寬松，已用于禾本科作物生物固氮的研究［7］。本研究在室內限菌條件下利用綠色熒光蛋白(GFP)標記A．caulinodans侵染小麥種子，篩選對其敏感小麥品種，探索不同菌液濃度和添加葡萄糖對其浸種侵染效率的影響，利用熒光顯微鏡檢測 GFP標記A．caulinodans在小麥幼苗根中的定殖規律。田間試驗結果表明A．caulinodans浸種侵染對不同小麥品種均具較明顯的促生作用，為深入研究A．caulinodans與小麥互作機制，更好地將其應用于農業生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1．1 小麥品種與菌株 小麥品種小偃22、小偃6號、西農979和陜253由西北農林科技大學農學院提供;綿陽19和鄭引1號均由西北農林科技大學生命科學學院保存;周麥18和矮抗58為市售小麥種子。綠色熒光蛋白(GFP)標記A．caulinodans含pHC60質粒，TCR由中國科學院植物研究所饋贈。

1.1.2 培養基與培養條件 TY液體培養基(胰蛋白胨5 g/L，酵母粉 3 g/L，CaCl2·2H2O 0.88 g/L，pH 7.4)用于A．caulinodans的活化與擴培，28℃，220 r/m培養至對數生長期備用。

YMA固體培養基(甘露醇 10 g/L，酵母粉3 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCO33g/L，瓊脂粉 18 g/L，pH 7.0)用于從接菌小麥體內分離A．caulinodans和計數。

1.2 方法

1.2.1 種子處理及限菌培養 選取飽滿、均勻一致的小麥種子，先用1%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水清洗3次;再用75%酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，進行表面消毒。參照Senthilkumar方法將表面消毒的種子均勻置于大試管(高23cm，直徑4cm)中已滅菌的瓊脂–水固體培養基(瓊脂粉5g，蒸餾水1000 mL)(以下簡稱培養基)表面，種溝朝下，胚朝向同一個方向，進行限菌培養［8，11］。培養條件(ZPW－280B智能植物培養箱)：光照16 h，光強4級，溫度25℃，相對濕度46%;黑暗8 h，光強0級，溫度18℃，相對濕度37%。

1.2.2 敏感性品種篩選 室內條件下，將8個品種的小麥種子表面消毒，置于培養基上限菌培養，每管9粒，設4次重復。將培養至對數生長期的A．caulinodans于50 mL離心管中，8000 r/m離心10 min收集菌體，用PBS緩沖液(KH2PO40.24 g/L，KCl 0.2 g/L，NaCl 8 g/L，Na2HPO41.44 g/L，pH 7.4)稀釋，吸取1 mL PBS稀釋菌液(約1.0×108個/mL)加入到培養基表面;平行對照接1 mL PBS緩沖液。培養條件同上，接菌后第9 d測量不同小麥品種幼苗根長與株高。

1.2.3 浸種侵染 室內條件下，預先進行種子處理和限菌培養。選取對A．caulinodans敏感品種小偃22種子，表面消毒后置于培養基上，每管9粒，設4次重復，在種子萌發前，吸取1 mL PBS稀釋菌液(菌數約1.0×108個/mL)加入到培養基表面;平行對照接1mL PBS緩沖液。培養條件同上，接菌后第9d測量幼苗根長與株高，并統計萌發的根數。

1.2.4 不同菌液濃度浸種侵染 室內條件下，預先進行種子處理和限菌培養。再將培養至對數生長期(菌數約1.0×109個/mL)的A．caulinodans離心收集菌體，用PBS緩沖液分別稀釋為1.0×109個/mL、1.0×108個/mL、1.0×107個/mL、1.0×106個/mL四個不同濃度，分別加到培養基表面;平行對照接1 mL PBS緩沖液。培養條件同上，接菌后第9 d測量不同菌液濃度浸種侵染后小偃22幼苗根長與株高。

1.2.5 添加葡萄糖對浸種侵染的影響 室內條件下，預先進行種子處理和限菌培養。由于小麥種子和A．caulinodans均接種在培養基上，為了避免浸種侵染早期A．caulinodans與小麥幼苗競爭利用小麥種子碳源而影響小麥幼苗生長，設置事先將葡萄糖添加于瓊脂–水固體培養基中(1 L培養基添加1 g葡萄糖)、將1 g/L葡萄糖添加到PBS稀釋菌液(約1.0×108個/mL)中和不添加葡萄糖3種處理。吸取1 mL PBS稀釋菌液(約1.0×108個/mL)加入大試管中培養基上;平行對照接1 mL PBS緩沖液。培養條件同上，接菌后第9 d測量小偃22幼苗根長與株高。

1.2.6 熒光顯微鏡檢測和平板計數 選取接菌第3 d、第5 d、第7 d、第9 d等不同時期的幼苗根進行表面消毒，將沖洗液放置于含10 μg/mL四環素的YMA固體培養基上，28℃培養，用于檢測表面消毒是否徹底。然后徒手切片，制片，用熒光顯微鏡檢測GFP標記A．caulinodans在小麥幼苗根組織內部的分布狀況。離心收集菌體，用PBS－甘油緩沖液(含30%甘油PBS緩沖液)稀釋為1.0×109倍、1.0×108倍、1.0×107倍、1.0×106倍，均勻涂布到含有10μg/mL四環素的YMA固體培養基，28℃倒置培養，每個梯度設4個重復，計算平板菌落的平均值。

1.2.7 田間試驗 田間試驗采用6個小麥品種(表1)。將培養至對數生長期的A．caulinodans菌液用無菌水稀釋成 1.0×108個/mL，向其中添加KH2PO40.5 g/L，1%(NH4)2Mo2O7·4H2O 1 mL/L和吐溫20 50 mL/L，采用淀粉與無菌水稀釋菌液混合后均勻拌種。同等條件下以無菌水替代A．caulinodans與淀粉混合后均勻拌種，作為平行對照，室溫下陰干備用。

試驗于2010～2011年度在西北農林科技大學試驗田中進行。前茬為夏閑地，地勢平坦，肥力中等，土壤中有機質含量 14.5 g/kg，速效氮 38.7 mg/kg，速效磷 11.2 mg/kg，速效鉀 120.0 mg/kg，灌溉方便。每個小麥參試品種設置4個處理和4個對照，采用隨機區組排列，行距15 cm，小區面積10 m2(2 m×5 m)，劃分保護行。其他田間管理同高產大田。

試驗數據采用 Excel和 SPSS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 小麥8個品種對A．caulinodans的敏感性差異

室內限菌條件下，A．caulinodans對8個品種小麥幼苗均具有促生作用，但不同品種對A．caulinodans的敏感程度不同。接菌后第9d測量處理與對照小麥幼苗根長和株高(圖1)，對根長經過正態性檢驗，其數據符合正態性分布，通過最小顯著差異法(LSD)檢驗，得出綿陽19、小偃6、西農979和小偃22 的 P 值分別為 0.030、0.002、0.007 和 0.008，在0.05水平上差異顯著。對株高經過正態性檢驗，其數據符合正態分布，通過最小顯著差異法(LSD)檢驗，得出小偃22和綿陽19的P值分別為0.032和0.007，在0.05水平上差異顯著。綜合以上分析，以小偃22差異最顯著，接菌后幼苗平均根長較對照增加了14.94%，平均株高較對照增加了9.38%，可作為首選試驗品種用于深入研究A．caulinodans與小麥相互作用的分子機制。

圖1 A．caulinodans浸種侵染8個小麥品種后第9d小麥幼苗根長與株高Fig．1 Seeding root lengths and shoot heights of eight wheat cultivars after 9 days of infection with A．caulinodans

2．2 浸種侵染 A．caulinodans對小麥幼苗生長的影響

室內限菌條件下，用PBS稀釋A．caulinodans菌液(約1．0×108個/mL)浸種侵染小偃22，接菌后第9 d統計小偃22幼苗根長、萌發根數和株高結果顯

2.3 不同菌液濃度浸種侵染對小麥幼苗生長的影響

用PBS緩沖液將擴培至對數生長期的A．caulinodans(約 1.0×109/mL)分別稀釋為1.0×109個/mL(A)、1.0×108個/mL(B)、1.0×107個/mL(C)、1.0×106個/mL(D)。室內限菌條件下，用4個不同濃度菌液浸種侵染小偃22，接菌后第9 d測量結果顯示，A、B、C和D幼苗平均根長較對照分別增加了 7.82%、20.11%、17.14%和14.87%，B、C和 D平均株高較對照分別增加了22.48%、12.51%、11.93%，但是在A濃度下平均株高較對照降低了3.27%(圖4)，表明過高的菌濃度浸種侵染對小麥幼苗生長具抑制作用，菌液濃度菌示，浸種侵染后小麥幼苗萌發5和6個根的比例明顯增加，萌發3和4個根的比例下降(圖2)。平均根長較對照增加了17．04%，平均株高較對照增加了8．37%(圖 3)，表明A．caulinodans浸種侵染對小麥種子生根萌發和幼苗生長具明顯促生作用。數為1.0×108個/mL最適于浸種侵染。

2.4 添加葡萄糖對A．caulinodans浸種侵染小麥幼苗生長的影響

在瓊脂–水固體培養基中添加濃度為1 g/L的葡萄糖，對小麥幼苗根的伸長具明顯抑制作用;未添加葡萄糖浸種侵染后的幼苗平均根長較對照僅增加了5.84%，平均株高較對照增加了18.65%。但是在A．caulinodans菌液中添加1 g/L葡萄糖，浸種侵染后幼苗平均根長較對照增加了8.65%，平均株高較對照增加了23.24%，促生效果更加明顯(圖5)。表明添加葡萄糖對A．caulinodans浸種侵染小麥后的促生效果具有輔助作用。

2.5 熒光顯微鏡檢測GFP標記A．caulinodans在小麥幼苗根中的定殖

利用熒光顯微鏡檢測浸種侵染小麥幼苗根中的GFP標記A．caulinodans。結果顯示，與對照(圖6A)相比，A．caulinodans可通過根毛和側根裂隙(圖6 C)進入根部組織，在根維管組織和細胞間隙定殖(圖6B)。對檢測到GFP標記A．caulinodans組織進行表面消毒，研磨后進行平板計數，根部A．caulinodans為2.4 ×107，再次表明A．caulinodans可在小麥根組織內部定殖。

2.6 田間試驗與統計

圖6 GFP標記A．caulinodans在小偃22幼苗根內定殖熒光顯微鏡圖Fig．6 Colonization of GFP －labeled A．caulinodans in roots of wheat seedling by fluorescence microscope

在同等栽培條件下，A．caulinodans浸種侵染除周麥18與對照間產量差異不大外，其他5個參試品種A．caulinodans浸種侵染較對照實際產量均有增加，小偃22增產1273 kg/hm2，小偃6號增產979 kg/hm2，西農 979增產 772 kg/hm2，矮抗 58增產535 kg/hm2，綿陽19增產265 kg/hm2。小偃22和小偃6號A．caulinodans浸種侵染與對照相比成穗數、穗粒數和千粒重差異顯著，進行SPSS單因素方差分析結果，經F檢驗在0.05水平上差異顯著。其中小偃22各項指標增長最為明顯，千粒重較對照增加了3.5 g，產量較對照增加了23.82%(表1)。

表1 小麥產量及構成要素Table 1 Wheat yield and yield components

3 討論

3.1 A．caulinodans浸種侵染小麥體系的優化

植物與細菌的相互作用具有種屬專一性，某些細菌的基因型與一定基因型的植物品種間存在最佳配合［9－10］。結合農業生產實際，高效浸種侵染體系的建立與聯合固氮菌在非寄主植物中定殖與遷移能力密切相關，較高的細菌群體密度可彌補聯合固氮菌在非寄主植物中有限的定殖能力。

本研究室內限菌試驗與田間試驗結果一致表明小偃22為對A．caulinodans敏感的小麥品種;通過優化菌液濃度、添加外源葡萄糖等措施，優化了室內限菌條件下A．caulinodans浸種侵染小麥的體系;結合大田實際，在A．caulinodans菌液中添加鉬元素以增強A．caulinodans固氮酶的活性，添加吐溫20、淀粉等措施使菌液與小麥種子充分混合均勻，室溫陰干，建立了大田條件下A．caulinodans侵染小麥體系，對于進一步深入研究A．caulinodans與小麥相互作用的分子機制，更好地將其應用于農業生產實際具有重要意義。

3.2 A．caulinodans在小麥幼苗根系內的定殖

聯合固氮菌可從傷口和自然開口(側根裂隙、氣孔、莖皮孔)侵染非豆科植物，定殖于根的表皮、皮層和維管系統的細胞間隙和細胞內，形成生態小境［11］。遲峰等研究表明定殖于植物根內的固氮菌可向上遷移，在水稻中可到達葉鞘和葉［12－13］，在煙草中可到達莖、葉、甚至在生殖器官子房中也有固氮菌定殖［11］。劉元等研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilenseYu62)在玉米根中的定殖規律［14］。劉華偉等研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilenseYu62)在小麥體內的定殖規律及其促生作用［15］。

本研究利用熒光顯微鏡檢測發現，小麥幼苗根與根圍環境在A．caulinodans浸種侵染過程中扮演著重要角色。A．caulinodans可通過根毛和側根裂隙侵入小麥根部，進入根維管束組織，并在維管束組織和細胞間隙中定殖，本研究結果與遲峰等、劉元等研究固氮菌在水稻、煙草、玉米等非豆科作物中的分布定殖規律一致［11，13－14］。

3.3 A．caulinodans對小麥的促生作用

非豆科植物與聯合固氮菌相互作用揭示了一個另一形式的固氮系統，聯合固氮菌還可作為植物促生菌促進植物生長，增加產量，并不會對植物造成病害或傷害，從而為非豆科植物尤其是禾本科作物生物固氮提供了一個更廣闊的研究領域。

遲峰等用A．caulinodans等根瘤菌侵染水稻、煙草種子，利用激光共聚焦顯微鏡檢測到GFP標記根瘤菌作為聯合固氮菌分布植物全身，并提高植物光合作用效率，促進植物生長。應用蛋白質組學方法研究表明接種固氮菌促進了水稻防御、光合、代謝等相關蛋白的表達，與光合作用和能量等相關一些蛋白表達顯著上調［11，16］。Senthilkumar等在遲峰工作基礎上，利用A．caulinodans接種水稻，熒光顯微鏡檢測結果表明GFP標記A．caulinodans遍布水稻各組織。接種A．caulinodans可顯著提高水稻蛋白質含量、總氮量和固氮酶活力，生物質總量相比對照提高5.4% ～16%［8］。

聶延富、陳廷偉等利用低濃度的2，4－D誘發小麥根部產生瘤狀結構(類根瘤)，A．caulinodans可侵染并在類根瘤內的細胞間隙和細胞內大量增殖，并向結瘤小麥提供 16% ～ 23% 的氮素［17，7］。對A．caulinodans離體發酵培養驗證其能產生吲哚乙酸(IAA)及赤霉素(GA)類物質［18］。潘佩平等初步研究了接種A．caulinodans泌銨型突變株對盆栽小麥生長的影響［19］。

田間試驗研究結果顯示A．caulinodans浸種侵染使小偃22穗數和穗粒數較對照增多4.54%和9.80%、千粒重較對照增加8.01%、產量較對照提高1273 kg/hm2，平均增產23.82%，表明A．caulinodans浸種侵染對小偃22具有較明顯的促生作用。但A．caulinodans在小麥體內定殖是否具有固氮作用?如何提高A．caulinodans聯合固氮的效率有待于進一步深入研究。

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