RP-HPLC定量三乙胺法測定中藥黃連中鹽酸小檗堿的含量

李彩虹，彭罡，周克元

(廣東醫學院 1.生物化學與分子生物學教研室;2.醫學活性分子研究重點實驗室;3.中藥新藥研究所，廣東 東莞 523808)

黃連為毛茛科植物黃連(coptis chinensis franch)、三角葉黃連(Coptis deltoideaC.Y.Chen et Hsiao)或云連(Coptis teetaWall1.)的干燥根莖，主要含有小檗堿、黃連堿、藥根堿、甲基黃連堿等生物堿成分，其中以小檗堿含量最高［1］。《中國藥典》(2005年版)中測定黃連中小檗堿含量的方法主要為薄層色譜法［2］。此外，采用高效液相色譜(HPLC)法可更加精確鑒定黃連中鹽酸小檗堿及其含量。

鹽酸小檗堿(Berberine)為非處方藥，具有廣泛的藥理作用。近年來國內外研究發現，在體外該類化合物濃度在每毫升微克級水平時，可抑制人白血病K562細胞、食管癌 YES細胞、肝癌 HepG2細胞、結腸癌colon26/colon20細胞、人早幼粒白血病HL-60細胞、人胃癌SGC-7901細胞、鼻咽癌CNE-2Z細胞等多種腫瘤細胞的生長，促進人早幼粒白血病HL-60細胞、人胃癌細胞MGC-803和SGC-7901的分化，誘導人胃癌MGC-803和 BGC823細胞凋亡［3］，促進 Hela細胞凋亡［4］。作者首次使用反向高效液相色譜(RP-HPLC)法測定黃連中鹽酸小檗堿的含量，為控制黃連藥材、黃連提取物中間固體和鹽酸小檗堿片的質量提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀，廣東醫學院色譜工作站。黃連藥材購于重慶西部制藥有限責任公司中藥分公司(生產許可證號:渝Y20060117)，鹽酸小檗堿系廣東醫學院醫學活性分子研究重點實驗室從黃連藥材中提取分離，鹽酸小檗堿標準品(供含量測定用，編號110713-200911，由中國藥品生物制品檢定所提供)，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，磷酸、三乙胺等其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Luna C18柱(150 mm×4.60 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(25 ∶75)，每 1 000 ml 0.1%的磷酸溶液中加入50 μl的三乙胺(掃尾劑)進行洗脫，流速為 1 ml·min－1，檢測波長為 340 nm，柱溫為25℃，進樣量為10 μl，理論塔板數按鹽酸小檗堿峰面積計算應不低于3 000積分。

2.2 標準曲線

精密稱取鹽酸小檗堿對照品12.30 mg，置50 ml量瓶中，加入甲醇，超聲15 min溶解，并稀釋至刻度，即配制濃度為 246.0 μg·ml－1的對照品貯備液。對照品貯備液設進樣量為 1、2、3、5、7、10 μl，依次注入色譜儀，測定峰面積，以鹽酸小檗堿對照品含量(X)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。進行線性回歸，得回歸方程。鹽酸小檗堿回歸方程及線性系數見圖1，鹽酸小檗堿含量在0.246 ～2.460 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

圖1 鹽酸小檗堿標準曲線圖Fig 1 The standard curve of BH

2.3 供試品制備

酸性水溶劑煎煮法提取黃連中的鹽酸小檗堿，再利用熱蒸餾水溶解，抽濾，重結晶，最后用無水乙醇溶解，抽濾，重結晶(無水乙醇重結晶法重復3次)，得鹽酸小檗堿精制品［5］。取精制樣品適量，研細，精密稱取6.3 mg，置容量瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，過濾，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，即得。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品貯備液，按上述色譜條件連續進樣5次，測得峰面積及相對標準偏差(RSD)結果見表1，鹽酸小檗堿峰面積的RSD=0.41%，表明儀器精密度良好。

表1 鹽酸小檗堿峰面積及RSDTab 1 Peak area and RSD results of BH

2.5 陰性試驗

制備鹽酸小檗堿陰性試液，依所給色譜條件操作，得色譜圖，與對照品、供試品色譜圖比較，結果見圖2。表明在鹽酸小檗堿峰處(T=7.88 min)無干擾。

圖2 鹽酸小檗堿陰性試驗圖譜Fig 2 HPLC chromatograms of negative test of BH

2.6 重現性試驗

分別制備供試品溶液6份，根據同樣色譜條件，取10 μl進樣，測得峰面積及RSD，結果見表2。鹽酸小檗堿峰面積的RSD=0.27%，表明方法精密度良好。

表2 鹽酸小檗堿峰面積及RSDTab 2 Peak area and RSD results of BH

2.7 穩定性試驗

供試品溶液分別在 0、0.5、1、2、4、8、12、24 h 測定，測得峰面積及RSD，結果見表3。鹽酸小檗堿峰面積的RSD=0.80%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

表3 鹽酸小檗堿峰面積及RSDTab 3 Peak area and RSD results of BH

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知準確含量的同一樣品9份，分別精密加入上述對照品貯備溶液 0.75、1.0、1.2 ml，然后按供試品溶液的測定項下操作、測定，結果見表4。鹽酸小檗堿平均回收率 =100.1%，RSD=1.60%(n=9)，表明方法準確度良好。

表4 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗結果Tab 4 The recovery results of sample

2.9 樣品測定

吸取2.3項下供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，用外標法計算樣品中鹽酸小檗堿的含量，結果見表5。所提取的鹽酸小檗堿的純度為87.62%。

表5 鹽酸小檗堿含量及RSDTab 5 The content and RSD results of BH

3 討 論

利用酸性水溶劑煎煮法提取中藥黃連中的小檗堿，并用重結晶精制法對鹽酸小檗堿粗品進行純化，可得到純度高達87.62%的鹽酸小檗堿。在0.246～2.460 μg范圍內，鹽酸小檗堿含量與峰面積積分值呈良好的線性關系。實驗儀器精密度良好，本提取方法精密度和準確度良好，供試品溶液在24 h內基本穩定。

參照相關文獻［6-7］，本實驗曾采用甲醇-乙腈-0.05 mol·L－1磷酸二氫鈉(20 ∶30 ∶50)，乙腈-1%磷酸(60∶40)洗脫液進行洗脫，分離出現拖尾現象。現有的研究中，也有加入掃尾劑來分析鹽酸小檗堿含量的方法，但都沒有對加入的掃尾劑進行定量。我們在不斷試驗摸索過程中發現，流動相采用乙腈-0.1%磷酸(25∶75)，每1 000 ml 0.1%的磷酸溶液中定量加入50 μl的三乙胺(掃尾劑)進行洗脫，分離效果較好，拖尾現象減弱，可快速測定黃連中鹽酸小檗堿的含量。將掃尾劑定量到50 μl加入流動相中后，用來測定鹽酸小檗堿的含量，可得到較好的分析結果，為準確、快速測定鹽酸小檗堿含量提供了參考。

［1］王慕鄒.常用中草藥高效液相色譜分析［M］.北京:科學出版社，1999:315-318.

［2］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)［S］.2005版.北京:化學工業出版社，2005:214.

［3］李波，朱維良，陳凱先.小檗堿及其衍生物的研究進展［J］.藥學學報，2008，43(8):773-787.

［4］YOUN M J，SO H S，CHO H J，et al.Berberine a natural product combined with cisplatin enhanced apoptosis through a mitochondria/caspase-mediated pathway in HeLa cells［J］.Biol Pharm Bull，2008，31(5):789-795.

［5］席國萍，宋國斌.黃連中小檗堿提取方法研究進展［J］.貴州農業科學，2009，37(1):8-10.

［6］李寶明，何麗一.高效液相色譜法測定霉滅滴膠囊中鹽酸小檗堿的含量［J］.藥物分析雜志，1999，19(6):128-129.

［7］楊廣民，歐陽榮，王宇紅，等.高效液相色譜法測定春雨燒傷膏中鹽酸小檗堿的含量［J］.湖南中醫學院學報，2004，24(4):20-22.