高壓氧對腦出血大鼠腦內HIF-1α表達和腦水腫的影響

王愛岳，李 強，周治平，許瓊冠

(1.中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院神經內科，海南 海口 570208；2.海南省農墾總醫院神經外科，海南 海口 570311)

腦水腫是腦出血后最主要的繼發性病理生理改變，有效治療腦水腫是減輕腦繼發損害、保護和促進神經功能恢復的重要措施[1]。近年來國內外學者對高壓氧(Hyperbaric oxygen，HBO)治療腦出血進行了較為廣泛的研究，并且證實HBO有明確的療效，但對其作用的機制尚不清楚[2]。缺氧誘導因子-1α(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)是一種隨著細胞內氧濃度變化而調節基因表達的轉錄激活因子，任何氧濃度降低的條件下都可誘導細胞快速、大量的表達。我們既往的研究曾發現[3]，HIF-1α在腦出血后血腫周邊腦組織中表達增加，并且其表達情況和腦水腫程度密切相關。但是在HBO作用下，血腫周邊腦組織中HIF-1α的表達情況目前尚不明了。本實驗擬對HBO作用后血腫周邊腦組織中HIF-1α的表達變化進行研究，探討HBO在治療腦水腫、改善預后方面的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠88只，體重(250±30)g，雌雄不限，中南大學實驗動物中心提供；鼠抗兔HIF-1α單克隆抗體購于加拿大Chemicon公司，二抗及DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司。伊文思蘭(Evane blue，EB)和甲酰胺購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 88只大鼠隨機分為假手術對照組(sham組，8只)、腦出血組(ICH組)和腦出血+高壓氧治療組(HBO治療組)(40只)。其中ICH組和HBO治療組根據出血后時間又平均分為6 h組、24 h組、3 d組、7 d組和14 d組，每組8只。

1.2.2 腦出血動物模型制備 大鼠術前禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔內注射麻醉。固定大鼠頭部于立體定向儀上，矢狀切開頭皮，暴露右側頂骨，調節定向儀使前后囟處于同一水平面上，于冠狀縫后4 mm、中線旁4 mm，牙鉆鉆一直徑約1 mm的骨孔，硬膜保持完整。微量注射器抽取股靜脈血50 μl，并將微量注射器固定于立體定向儀上沿骨孔垂直刺入腦組織3 mm，緩慢將自體血注入腦內，留針15 min后，緩慢拔出穿刺針，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮。假手術組除不注射自體血外，余操作同上。動物麻醉蘇醒后允許自由進食水。

1.2.3 高壓氧處理 HBO治療組大鼠置于DWCI50-300型透明動物實驗艙內，純氧洗艙5 min，升壓5 min至0.1 MPa(2個大氣壓)后穩壓，吸純氧45 min，減壓10 min。腦出血后3 h行高壓氧治療1次，24 h、3 d、7 d和14 d在每天同一時間行高壓氧治療1次。sham組和ICH組處于常壓空氣環境中不行高壓氧處理。

1.2.4 標本制取 到相應時間點再次麻醉動物，動物斷頭后快速于冰盤上取出全腦，冠狀切開腦組織，取血腫周邊腦組織約2 mm×2 mm×2 mm，經4%的多聚甲醛固定后石蠟包埋，制成5 μm連續切片進行HE染色和HIF-1α免疫組化染色。另分別取血腫周邊腦組織約100 mg進行腦組織含水量測定。

1.2.5 腦組織含水量測定 采用干/濕比重法進行腦組織含水量測定。將所取的腦組織以濾紙吸凈其表面血液和腦脊液，分析天平快速稱重后置之于105℃恒溫烤箱內烘烤48 h，間隔12 h兩次稱重，重量變化小于0.2 mg時記錄稱量結果并取其平均值。以換算公式：腦組織含水量(%)=[(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重]×100%，計算腦組織含水量。

1.2.6 HIF-1α免疫組化染色步驟 ①切片常規脫蠟至水；②新鮮配制的3%H2O2，室溫10 min滅活內源性酶；③微波修復抗原；④滴加封閉液20 min；⑤滴加HIF-1α單克隆抗體37℃反應1 h，4℃過夜；⑥生物素化山羊抗小鼠二抗37℃孵育20 min；⑦滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，37℃反應20 min，DAB顯色5 min；⑧蘇木素輕度復染，脫水，透明，中性樹膠封片。

1.2.7 免疫組化結果判斷 HIF-1α免疫組化結果陽性為細胞核染色，部分細胞漿染色。參照Remmele等的IRS(Immuno-reactive score)法進行計分，高倍鏡下(×400)隨機選取5個視野，以HIF-1α表達陽性細胞率和染色強度的計分之乘積進行判斷。陽性細胞數所占的百分比為：未著色記為0分，1%～10%記為1分，11%～50%記為2分，51%～80%記為3分，81%～100%記為4分。陽性細胞著色強度分為：未著色記為0分，淡黃色記為1分，黃色記為2分，棕黃色記為3分。兩計分相乘為最后結果。

2 結 果

2.1 HIF-1α在血腫周邊腦組織中的表達情況 HIF-1α主要表達于神經細胞胞核，胞質中也有少量表達。sham組腦組織中HIF-1α蛋白呈陰性表達，ICH組和HBO治療組均可見HIF-1α表達，與sham組比較，ICH組和HBO治療組HIF-1α表達明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。HBO治療組與ICH組大鼠腦組織中HIF-1α表達第14天時比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，其他時間比較，HIF-1α表達差異無統計學意義(P＞0.05)(見表1、圖1、圖2)。

圖1 腦出血14 d HIF-1α在細胞核中的表達(SP法×400)

圖2 高壓氧治療14 d HIF-1α在細胞核中的表達(SP法×400)

2.2 腦出血后腦組織含水量變化的比較 腦出血3 d內，腦組織含水量進行性增加且于出血后3 d達到高峰，此后腦組織含水量逐漸下降。與Sham組相比，ICH組和HBO治療組在出血后各時間點腦組織含水量明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。HBO治療組與ICH組大鼠腦組織含水量第14天時比較差異有統計學意義(P＜0.05)，其他時間相比較，腦組織含水量差異無統計學意義(P＞0.05)(見表1)。

表1 腦出血后不同時間觀測指標結果比較(±s，n=8)

表1 腦出血后不同時間觀測指標結果比較(±s，n=8)

注：與sham組腦組織比較，*P＜0.05，與ICH組同時間比較，ΔP＜0.05。

組別 腦出血時間 觀測指標腦組織含水量(%)HIF-1α表達IRS評分6 h 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d sham組ICH組HBO組77.63±0.68 78.97±1.43*79.86±1.06*80.59±1.14*79.30±1.36*78.39±1.12*77.68±0.91*79.52±1.67*79.91±1.76*79.72±1.74*77.08±1.18Δ 0.00±0.00 3.25±1.58*6.87±3.09*8.62±2.72*7.25±2.37*4.37±2.13*3.37±1.41*4.87±1.64*7.25±2.76*5.12±2.59*2.25±1.58Δ

2.3 HIF-1α蛋白表達與腦水腫的相關性 相關分析顯示，ICH組HIF-1α蛋白表達與腦水腫的程度成正相關，r=0.446，P＜0.05；HBO治療組HIF-1α蛋白表達與腦水腫的程度無相關性，r=0.319，P＞0.05。

3 討 論

HIF-1是普遍存在于人和哺乳動物細胞內的缺氧應答調控因子，在調節缺氧誘導的基因表達中發揮重要作用。HIF-1是由α和β大小兩個亞基組成的核轉錄因子，其中α亞基為HIF-1所特有，是其主要功能單位，HIF-1的量和活性主要由HIF-1α決定[4]。HIF-1α在常氧狀態下不穩定，半衰期不到5 min，合成后迅速被泛素化，繼而由蛋白酶溶解[5]。而在缺氧狀態下，HIF-1α在胞漿內合成增加，半衰期明顯延長，從而對其下游基因，如：VEGF、MMPs、Glu-1、bax/bcl-2等基因進行調控。目前認為，HIF-1α與神經細胞在缺氧狀態下抗損傷機制的產生有密切關系[6]。

我們在實驗發現，HIF-1α蛋白在腦血腫周邊神經細胞中有明顯的表達，其原因可能與腦出血后應激反應所致的腦血管收縮和血腫壓迫致使血腫周邊腦組織中存在不同程度的缺血、缺氧有關。而隨著血腫壓迫時間的延長，部分缺血腦組織發生缺血后再灌注，使得HIF-1α蛋白表達進一步增加。這表明：HIF-1α的表達與神經細胞缺血、缺氧的時間密切相關[7]。我們在研究中也發現，腦出血后HIF-1α蛋白的表達和腦水腫的變化呈現一致性，相關分析顯示：出血后HIF-1α蛋白表達與腦水腫的程度成正相關關系(r=0.446，P＜0.05)，這就表明，HIF-1α蛋白參與了出血后腦組織水腫的形成。如能抑制HIF-1α的表達，將會有效減輕出血后腦水腫的程度。

已有研究表明，在一定的壓力和時間范圍內，高壓氧對缺血和水腫的腦組織存在保護作用[8]。我們在實驗中發現，腦出血后經過高壓氧治療，腦組織中HIF-1α表達程度及腦水腫程度都有明顯降低，說明高壓氧能有效減少HIF-1α表達并減輕腦組織水腫程度。但令人感興趣的是，ICH組HIF-1α表達與腦水腫的程度成正相關(P＜0.01)，而HBO治療組HIF-1α表達與腦水腫的程度則無相關性(P＞0.05)，這表明高壓氧治療腦水腫過程中可能存在多種途徑和機制，抑制HIF-1α表達僅是其中一種途徑。而有研究顯示[9]，高壓氧可通過抑制水通道蛋白4(AQP4)的表達，減輕腦組織的水腫程度。此外我們還發現：在6 h、24 h、3 d、7 d HBO治療組血腫周邊腦組織中HIF-1α表達程度和腦水腫程度與對應時間點不經高壓氧治療的ICH組比較差異無統計學意義，而在第14天時差異有統計學意義，這表明高壓氧治療的效果存在滯后性，早期和每日多次高壓氧處理可能更為有效降低腦組織水腫程度。

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