4～5歲兒童唾液中蛋白成分與患齲狀況的關系

王金東，劉壽桃，林煥彩，郝高峰，喬永剛

(1.深圳市婦幼保健院口腔疾病防治中心，廣東 深圳 518048；2.中山大學光華口腔醫學院口腔預防科中山大學口腔醫學研究所，廣東 廣州 510055)

穩定存在于唾液中的蛋白質達90多種，唾液蛋白可通過多種途徑影響齲病的發生發展，其含量和組成可隨年齡、機體的健康狀況而發生改變[1]。過往調查表明我國兒童乳牙齲患病率高且存在兩極分化傾向，兒童患齲程度存在明顯差異[2]，但目前尚缺乏基于流行病學調查基礎的不同患齲狀況兒童與唾液蛋白中關鍵組份的定量研究報道。本研究定量分析了不同患齲程度兒童唾液中總蛋白和部分唾液蛋白組份的含量，以期探討它們之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以本課題組2005年廣州從化市兒童齲病流行病學調查所得數據庫為基礎，采用單純隨機抽樣法選取4～5歲兒童80名，分為無齲組(Caries free group，dmft=0)40人，高齲組(Caries susceptible group，dmft≥5)40人，每組男女各半(齲病診斷按世界衛生組織1997年推薦的《口腔健康調查基本方法》第四版中的標準)。所有兒童及家長均知情并同意參加該項研究。排除有全身疾患者。

1.2 方法

1.2.1 總蛋白含量測定 上午9：00～11：00，采用吐取法收集受激全唾液約3 ml(混有血跡者棄之)，將唾液樣本收集至無菌離心管，冰存4 h內送回實驗室。4℃離心(10 000 r/min，60 mm)15 min，取上清-80℃保存備用。利用雙金雞納酸的雙縮脲反應，采用分光光度法測定，使用Tecan Sunrise酶標儀(瑞士TECAN)。

1.2.2 唾液蛋白電泳分析 采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳法(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)對 唾液樣本中的蛋白質進行分離。分離條件：濃縮膠120 V，100 mA；分離膠180 V，100 mA。考馬斯亮藍R-250染色，Ultra-lum Omega多功能化學發光成像系統掃描，1D Scan Ex專業凝膠圖像分析軟件測定目標條帶。采用寬分子量蛋白質marker(美國Sigma)。

1.3 統計學方法 數據經SPSS13.0統計軟件處理，采用兩組獨立樣本t檢驗，設α=0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同齲易感兒童唾液總蛋白含量 男、女合計唾液中總蛋白含量均為高齲組低于無齲組(P＜0.05)，不同性別兒童總蛋白含量兩組間差異無統計學意義(P=0.518)。

2.2 SDS-PAGE電泳分析結果 經15%SDS-PAGE檢測發現，10 000、28 000、38 000、56 000和77 000蛋白百分含量高齲組均高于無齲組(P＜0.05)，14 500蛋白百分含量兩組間差異無統計學意義(見表1，圖1)。

表1 兩組兒童唾液各蛋白組分百分含量比較(IA/μg，±s)

表1 兩組兒童唾液各蛋白組分百分含量比較(IA/μg，±s)

組別高齲組無齲組t值P值例數40 40--10 000蛋白29.22±11.46 23.19±11.77 2.324 0.023 14 500蛋白8.96±4.28 7.48±4.55 1.501 0.137 28 000蛋白19.17±11.84 13.00±6.19 2.924 0.005 38 000蛋白23.95±9.00 18.66±7.69 2.824 0.006 56 000蛋白87.10±39.21 61.76±26.24 3.398 0.001 77 000蛋白12.50±7.73 8.71±4.28 2.711 0.009

圖1 唾液蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖

3 討論

本研究發現高齲兒童唾液中總蛋白含量低于無齲兒童，不同性別兒童之間唾液中總蛋白含量差異無統計學意義。對4～5歲不同齲易感兒童刺激性全唾液總蛋白含量的研究鮮見報道，本研究結果與Tulunoglu等[3]對7～10歲兒童的研究一致。唾液中總蛋白含量隨年齡呈明顯的上升趨勢[4]。其與齲病的具體相關關系應深入研究。

本研究中唾液蛋白SDS-PAGE凝膠電泳可分離出7～14條可分析條帶，平均每個樣品可分離出10條，其中10 000、14 500、28 000、38 000、56 000、77 000位置的6種不同分子量蛋白條帶穩定出現。高齲組與無齲組比較條帶數目較為相似，Banderas-Tarabay等[5]和Shiba等[6]的研究結果與本研究相似。Schwartz等[7]對成人全唾液蛋白用SDS-PAGE分離出了34條條帶，本研究分離的蛋白條帶數目與之相比較少，可能與以下原因有關：1)目標人群不同，種族和年齡不同均可能導致唾液蛋白組成發生質和(或)量的變化；2)電泳條件不同，本研究選用Mini型垂直電泳系統，凝膠厚度0.75 mm；3)條帶分析標準不同，本研究只統計用1D Scan Ex凝膠圖像分析軟件可以分析的掃描條帶，而有的學者是視覺觀察與軟件分析相結合，觀察到的條帶均計算在內。

研究結果顯示，刺激性全唾液中10 000、28 000、38 000、56 000、77 000蛋白的百分含量均為高齲組高于無齲組；14 500蛋白的百分含量兩組間差異無統計學意義。

相對分子量為10 000的唾液蛋白是堿性富脯蛋白，28 000位置的為酸性富脯蛋白，56 000位置則有相當一部分為糖基化富脯蛋白。富脯蛋白可達受激唾液蛋白總量的10%，根據其糖基化程度分為堿性富脯蛋白、酸性富脯蛋白、糖基化富脯蛋白等[8]。本研究結果顯示10 000和28 000蛋白的百分含量高齲組均高于無齲組。胡云明等[9]用高效疏水液相色譜法對不同齲易感人群腮腺唾液蛋白檢測亦得出相同結果。Ayad等[10]利用高效液相色譜法對高齲組和無齲組成人腮腺液中的富脯蛋白進行了分離分析，未發現兩組間有差異。與本研究的結果不符，具體原因有待進一步的研究。

唾液中相對分子量為38 000的蛋白是SIgA，本研究結果顯示高齲組SIgA百分含量高于無齲組，提示致齲菌處于活躍狀態時，刺激機體免疫系統，致SIgA分泌增多，從而增強對牙體組織的保護作用，抑制齲病的發展。吳曉霞等[11]用非競爭性生物素-抗生物素酶聯免疫吸附法對4～5歲兒童非刺激性全唾液中SIgA濃度與齲病關系進行分析，認為高齲兒童SIgA百分含量低于無齲組。本研究結果與吳曉霞等[11]的研究不符，可能與檢測方法、樣本量大小、樣品處理方式等因素有關。

相對分子量為56 000位置的是唾液α-淀粉酶及其同功酶和糖基化富脯蛋白的混合蛋白，其中主要是唾液α-淀粉酶及其同功酶。在根面齲的研究中發現α-淀粉酶可以抑制牙體組織的脫礦[12]。景娟等[13]研究發現20～30歲的高齲人群α-淀粉酶百分含量高于無齲組，本研究結果與之一致。

本研究認為14 500蛋白百分含量兩組間差異無統計學意義。溶菌酶分子量為14 500，是宿主口腔先天性防御系統的關鍵組份。本研究結果與Stuchell等[7]采用免疫擴散法對成人檢測的結果一致。Bai等[14]對42～54個月幼兒的研究則發現高齲兒童唾液溶菌酶的含量比無齲兒童高。出現不同的結果可能與測定方法有別相關，本研究采用SDS-PAGE凝膠電泳，Bai等[14]利用比濁法進行檢測。雖然在體內和體外實驗中均表明溶菌酶可以明顯地抑制致齲菌的生長，但是唾液中溶菌酶含量與不同齲易感性的關系尚不明確。

高齲兒童刺激性全唾液中77 000蛋白的百分含量高于無齲組。唾液中乳鐵蛋白的分子量為77 000，乳鐵蛋白通過與鐵形成螯合物奪取細菌生長必需的鐵離子而抑制細菌生長，亦能直接殺滅部分細菌。本研究結果與Sikorska等[15]多位學者的研究相符，其對15歲組人群研究發現，齲易感性與唾液中乳鐵蛋白含量高度相關，齲面值越高，乳鐵蛋白百分含量也越高[15]。粘附能力強的細菌可刺激唾液中乳鐵蛋白的分泌，乳鐵蛋白含量的增加又可協同唾液中其他蛋白抑制細菌的致齲作用。符合機體的生理性應激機制，提示乳鐵蛋白在乳牙齲病發生和發展中起重要作用。

乳牙齲的危害十分嚴重，唾液蛋白中關鍵組分在乳牙齲病的發生、發展中起著重要作用。今后應著重研究各蛋白組分在齲病發生發展中所起的具體作用，以期明確它們與乳牙齲的關系。

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