葛葉、葛蔓總黃酮化合物提取的優化設計

吳超，徐凌剛，何杭生，毛燕

（浙江農林大學 理學院，浙江 臨安 311300）

葛別名甘葛、野葛等，為豆科葛屬植物，葛Pueraria lobata（Willd）Ohwi in bull。產于我國南北各地，除新疆、青海和西藏外，分布全國。葛根供藥用，有解表退熱，生津止渴，止瀉的功能，并能改善高血壓病人的項強、頭昏、頭痛、耳鳴等癥狀[1]。葛葉有收斂止血、消腫止痛等作用。

黃酮類化合物是一類廣泛存在的化合物，具有廣泛的生理及藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、抗氧化作用[2]，有些黃酮類化合物具有利尿和調節血管滲透性的作用，有的具有抑制癌細胞的作用[3]。目前從中草藥提取分離黃酮類化合物報道較多，從五加科植物刺五加的花、葉及其果實中[4]、洋蔥[5]、山核桃皮中[2]、翻白草[6]提取分離出具有生物活性的黃酮類化合物。對葛葉和葛蔓的總黃酮類化合物的提取尚鮮見報道。本文采取不同的條件對葛葉、葛蔓總黃酮進行提取測定，用以討論從植物中提取同類化合物的應用價值，旨在為植物中有效成分研究和開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集

2008年10月在浙江林學院東湖區校園內，分別從葛上摘取葛葉和葛蔓。樣品洗凈，烘干，分別粉碎后裝入干燥的磨口瓶中備用。在試驗的同時測定含水率。葛葉樣品含水率為11.79%，葛蔓樣品含水率為2.85%。

1.2 提取方法

熱水提取。分別稱取試樣品1.0 g，在水浴中以不同的時間、不同的溫度和不同體積的水提取，過濾。濾液定容，待測總黃酮含量。

1.3 分析方法

以蘆丁為標準樣品，采用比色法對各提取液中的總黃酮含量進行測定[7]。

2 結果和分析

2.1 總黃酮提取的單因素影響

2.1.1 不同提取溫度對提取總黃酮提取率的影響

取樣品1.0 g，加水50 mL，分別在不同的溫度下提取60 min，然后測定總黃酮含量，見圖1。

圖1 不同的溫度條件下提取的總黃酮提取率Fig.1 Effect of temperature on total flavone content

從圖1中得出，隨著溫度的升高，葛葉的總黃酮提取率也隨之增加。當溫度在100℃時，總黃酮提取率達到最大值，表明溫度升高有利于葛葉的總黃酮提取。而葛蔓的總黃酮提取卻在80℃時，提取率最高，隨著溫度增高，含量降低。結果表明，溫度升高對葛葉的影響較為顯著，而對葛蔓沒有大的影響，因此，兩者的總黃酮提取溫度應選擇在80℃～100℃。

2.1.2 不同時間對提取總黃酮提取率的影響

取樣品1.0 g，加水50 mL，水浴溫度100℃，分別以不同時間提取，試驗重復2次，然后測定總黃酮提取率，結果見圖2。

圖2不同的時間條件下提取的總提取率Fig.2 Effect of extracting on total flavone content

圖2的結果表明，提取時間對葛葉總黃酮提取率有所影響，而對葛蔓的總黃酮提取率影響不大，在提取時間為30 min時，葛葉的總黃酮提取率最高，隨著時間延長葛葉總黃酮提取率隨之減少。說明提取時間達到一定程度時，由于某些黃酮類化合物的熱穩定性較差，加熱時間長容易分解，導致總黃酮提取率降低。說明提取時間達到一定時總黃酮的提取已基本完成。對葛蔓來說，在提取時間為30 min時，總黃酮提取率最高，隨著時間延長葛蔓總黃酮提取率略有降低并基本保持不變，說明延長提取時間意義不大，故兩者的提取時間為30 min～40 min為宜。

2.1.3 不同的溶劑體積對提取總黃酮提取率的影響

取樣品1.0 g，加熱水，分別用不同的體積提取，溫度100℃，提取時間為60 min，所得結果見圖3。

圖3 不同的容積體積條件下提取的總黃酮提取率Fig.3 Effect of solvent volume on total flavone content

由圖3可知，隨著溶劑體積的增加，葛葉和葛蔓的總黃酮提取率也隨之增加，溶劑體積為60 mL時，葛葉的總黃酮提取率最高，而在50 mL～60 mL時，葛蔓的總黃酮提取率最高，表明兩者提取的溶劑體積都有各自的最佳選擇，即以50 mL為好。故而，溶劑體積選擇范圍可設定為50 mL～60 mL。

2.2 綜合試驗設計方案的確立

根據上述各種因素影響的試驗結果，綜合考慮采用二次通用旋轉組合設計[7－8]，進一步考察提取時間、提取溫度，及溶劑體積對提取效果的影響。用MATLABSU數學軟件處理數據，X1（℃）、X2（min）、X3（mL）分別表示溫度、時間和溶劑體積分數，y/%表示產率，考慮溫度變化范圍為20℃～100℃，時間變化范圍為20 min～60 min，溶劑體積變化范圍為20 mL～60 mL。各因素水平編碼值如表1全部試驗設計20個處理，其中15～20號為零水平處理。試驗方案及結果見表2。

表1 正交旋轉組合設計因素水平編碼表mLTable 1 Coding value of current spinning combination design

2.3 綜合試驗結果統計分析

通用旋轉組合設計方案及結果，見表2。

從表2中可以看出，在提取時間和溶劑體積相同的條件下，9號與10號比較，葛葉的提取率提高126%，而葛蔓的產率提高6.25%，說明提取溫度對葛葉總黃酮提取率有顯著影響，對葛蔓卻影響不大。從實驗結果可看出，隨著溫度的升高產率增加。其次，11號與12號比較，提取溫度和溶劑體積相同的條件下，提取時間的增加葛葉的產率提高38%，葛蔓的產率提高6.25%。說明提取時間對葛葉影響較大，而對葛蔓的影響不大。3號與4號比較，在提取溫度和提取時間相同的條件下，溶劑體積的增加葛葉的產率提高8.3%，葛蔓的產率提高20%，說明溶劑體積對葛蔓的影響較大。

表2 通用旋轉組合設計方案及結果Table 2 Scheme and result of current spinning combination design

2.4 進一步對葛葉、葛蔓的試驗結果作統計分析

2.4.1 根據表2試驗結果建立三元二次回歸方程

2.4.2 回歸方程的顯著性檢驗

由樣本數據計算得回歸關系顯著性檢驗值為：葛葉F=14.71，葛蔓：F=7.355 4，臨界值F0.01（9，10）=4.94，所以F＞F0.01，表明葛葉、葛蔓對試驗結果均有顯著影響。

2.4.3 各回歸系數的顯著性檢驗

回歸方程中各變量作用的大小可通過t值檢驗來判斷，t值檢驗結果見表3。

表3 回歸系數顯著性檢驗Table 3 The t test result of regression coefficient

對于葛葉，其中x1（溫度）及x12對產率y有顯著的影響，其它的因素對產率影響較小，亦即產率與溫度之間存在顯著關系，溫度升高，產率增大，為此，我們將t檢驗值小于1的變量刪去，于是回歸方程優化為

對于葛蔓，其中x3（體積），x1x3及x32對產率y有極顯著影響，x12對產率y有顯著影響，其他因素均無顯著影響，因而可將t檢驗值小于1的變量從回歸方程中刪去，于是回歸方程優化為

利用回歸方程計算不同組合的擬合值推求最優方案，在X的編碼區間-1.682≤xi≤1.68，取步長為0.42，計算不同搭配組合時的總黃酮提取率擬合值共93=729個值。對于葛葉，其中產率≥1.10%的有102個，在這102個中x1（溫度）編碼值在1.258以上的占98%，x2（時間）編碼在0.418以上占67%，體積編碼均勻分布，說明產物與體積無關。綜合實驗條件可采取提取溫度以80℃～100℃，時間以 40 min～60 min，體積 40 mL～60 mL為宜。

對于葛蔓，其中產率≥0.175%的有150個，在這150個中x3（體積）編碼在0.418以上的占97%，x1（溫度）編碼在0.148以上的占78.7%，x2（時間）編碼均勻分布，即與時間無關，綜合試驗條件可采取提取溫度以80℃～100℃，體積40 mL～60 mL為宜，時間以40 min～60 min。

3 結論

實驗的結果表明，影響葛葉總黃酮提取率的主要因素是提取溫度，其次是提取時間，總黃酮提取率隨溫度升高，提取時間延長而增加，影響最小的是溶劑體積。而三者因素對葛蔓的影響均不大，因此，根據實驗的實際情況可將提取溫度設定為80℃～100℃、提取時間為 30 min～40 min、溶劑體積為 50 mL～60 mL，即可達到最佳的提取效果。

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[1]李樹剛.中國植物志[M].北京:科學出版社,1995:224－226

[2]張詠莉,詹苗,毛建文,等.山核桃樹皮中黃酮類化合物的提取及含量測定[J].新中醫，2009,41(7):104－106

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