茶葉多糖的純化工藝

王黎明，夏文水

（1.無錫商業職業技術學院，江蘇無錫 214153；2.江南大學，江蘇無錫 214036）

近年，茶多糖因具有較多的生理保健功能，引起了很多研究者的興趣，特別是從粗老茶中提取茶多糖，既可以開發保健食品，也可以綜合利用資源，成本低、價值高。但是茶多糖的提取純化過程中，初步純化工藝是個較難處理的工藝過程。如果方法選擇得當，純化效果好，速度快，成本低；反之，則效果差，速度慢，成本高。雖然純步純化工藝已有許多報道，但多數是就某個方面的純化工藝。倪德江等報道，Sevag法脫蛋白的效果主要在前三次，不同茶類，蛋白質的去除率不同[1]。陳海霞等則用聚酰胺吸附法脫除茶多糖中水溶性色素[2]。也有很多報道用氧化法，即用H2O2作氧化劑將色素氧化成無色物質。黃桂寬等用40%和60%的乙醇分級沉淀茶多糖，干燥后分別得淺黃色和灰白色兩種多糖TP－1和TP－2，得率分別為2.8%和0.7%，總糖含量分別為48.24%和57.71%，其中TP－1為中性雜多糖[3]。楊其林用CTAB沉淀茶多糖，得率為1.34%[4]。陳海霞等分別用醇沉淀法、超濾法和CTAB沉淀法制備了茶多糖粗提物[5]。汪東風等將粗多糖過Sephadex G200柱，0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，得茶多糖純化物[6]。王丁剛等也將茶多糖粗品過 Sephadex G200，用0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，得到純化的茶多糖[7]。嚴明潮等研究發現超濾膜的材料會直接影響茶多糖的含量和得率，研究認為選擇在50℃下浸提45 min，選用截留相對分子質量為8萬～10萬的聚砜膜在50℃、0.2 MPa下分離是比較理想的[8]。

本文將對茶多糖的初步純化工藝作較為詳細、系統的研究，側重于實用和低成本。

1 材料與方法

1.1 材料

五級綠茶由無錫翠竹茶葉有限公司饋贈，所有試劑均為國產試劑。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理及茶多糖提取方法

[8]。

1.2.2 粗多糖相對分子質量分布的測定

高效凝膠過濾色譜法，色譜柱：UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mmid×2；流動相：0.1M NaNO3；流速：0.9 mL/min；柱溫：45 ℃；多糖標樣：Dextran T－2000，Dextran T－500，Dextran T－70，Dextran T－40，Dextran T－10，Dextran T－5；分子量線性方程：Log Mol Wt=13.0－0.461T（r=0.997）。

1.2.3 Sevag法脫蛋白

茶多糖溶液中加入1/3體積的Sevag試劑（氯仿：正丁醇=4∶1），室溫下磁力攪拌 30 min，靜置 2 h，分離除去白色乳濁液。取少許多糖溶液，并稀釋至合適的濃度，苯酚－硫酸法測定多糖和考馬斯亮蘭法[9]測定蛋白質含量。

1.2.4 樹脂和聚酰胺的預處理

大孔吸附樹脂在乙醇中充分浸泡后，用乙醇洗至洗出液加適量水無白色渾濁，再用去離子水洗凈乙醇，加5%HCl溶液浸泡3 h，去離子水洗至中性，加5%NaOH浸泡3 h，去離子水洗至中性，備用。聚酰胺用水充分溶脹后，依次用5%HCl和5%NaOH洗滌，方法同上。

1.2.5 脫色材料的篩選

取預處理過的聚酰胺和大孔吸附樹脂各10 mL，加入20 mg/mL茶多糖溶液20 mL，攪拌過夜，充分靜置，過濾，380 nm測定吸光度[10]，計算脫色率。并測定多糖和蛋白質含量，計算多糖保留率和蛋白去除率。

1.2.6 聚酰胺動態脫色

取預處理過的聚酰胺，裝柱（2.6 cm×80 cm），使用前用50%甲醇水溶液洗滌2個柱體積，再用去離子水平衡。茶多糖配制成20 mg/mL溶液，上柱，去離子水洗脫（28 mL/h）1個柱體積后改用0～70%乙醇梯度洗脫。380 nm測定洗脫液吸光值，計算脫色率。苯酚－硫酸法檢測多糖，計算多糖保留率。

1.2.7 Sephadex G50脫色

樣品上Sephadex G50（1.6×100 cm）。上樣量：柱體積的 5%；洗脫液：0.1 M NaCl，流速：12 mL/h，380 nm檢測洗脫液吸光值，硫酸－苯酚法檢測多糖，收集多糖組分。

1.2.8 脫色率

1.2.9 多糖純化倍數

1.2.10 多糖保留率

1.2.11 蛋白去除率

2 結果與分析

2.1 粗多糖的得率及其分子量分布

茶多糖提取液中加入乙醇濃度為94%的工業酒精至乙醇濃度為70%，室溫過夜，離心，沉淀進行冷凍干燥，得率為3.2%，高于資料報道的2.97%的最高提取率，純度為47%。測定粗多糖的分子量分布，其主峰的相對分子質量為11 291，峰3的相對分子質量為451，說明茶多糖提取液中小分子雜質較多（圖1）。

2.2 粗多糖脫游離蛋白

常用的脫蛋白方法有Sevag法[11－12]、三氟三氯乙烷法[13]、三氯乙酸法[14－15]。茶多糖提取液中加入不同量的三氯乙酸（4℃環璄中），發現茶多糖溶液的顏色由淡黃色變為紅褐色，沒有白色沉淀形成。加入乙醇至70%濃度，靜置過夜，也沒有形成絮狀沉淀，用截留分子量為5000的透析袋透析48 h，檢測袋內溶液，發現袋內多糖含量極低，表明茶多糖被三氯乙酸降解，因此不宜用三氯乙酸脫除茶多糖中的雜蛋白，因而改用Sevag法，效果如圖2。

從圖2可以看出，用Sevag法除茶多糖中的游離蛋白，第1次效果最好，蛋白脫除量大，多糖損失小；3次以后，蛋白含量的變化很小，而多糖損失卻很嚴重，因此用Sevag法除茶多糖蛋白，重復3次即可。重復3次，茶多糖的總蛋白去除率約為28%，由原來的15%下降到了11%。

2.3 茶多糖脫色

2.3.1 脫色材料的篩選

茶色素是黃酮類和多酚類的氧化聚合物的異質類群，由茶紅素和茶褐素組成。茶紅素是主體，占茶色素總量的85%以上，以兒茶素二聚物和低聚物為主，茶褐素以兒茶素高聚物為主，占茶色素的10%～15%[16]。一般小分子量的茶紅素易溶于水，而大分子量的茶褐素易溶于醇。

乙醇沉淀多糖，可除去部分水溶性色素，但仍有大量醇溶性色素不能去除，需采用其它方法去除。常用的脫色方法中，金屬絡合法具有很強的選擇性，而氧化法是用H2O2將茶色素氧化為無色物質，未真正去除色素物質，因此這兩種方法均不宜采用。由于茶色素的酚羥基和多糖的醇羥基均可與堿性陰離子交換樹脂發生離子交換作用而形成牢固的作用力，需用高濃度的鹽和堿才能洗脫，而茶多糖在堿性條件下不穩定，因此需選用作用力較弱的吸附作用或氫鍵作用進行脫色。常用于脫色的作用力較弱的吸附劑有活性碳、硅藻土和吸附樹脂等，而聚酰胺常用于多酚類和黃酮類的分離[17]。活性碳和硅藻土通過表面作用將介質中直徑小于其孔徑的雜質吸附到孔隙中，而茶色素的相對分子質量分布較廣，因此該方法也不能完全去除茶多糖中色素。

大孔吸附樹脂和聚酰胺既具有表面吸附作用，又有氫鍵作用，是近代發展起來的一類有機高聚物吸附劑，其中 DM130、S8、HPD500、HZ801、AB8 、NKA2 是對黃酮和多酚類化合物有較好分離效果的大孔吸附樹脂。表1表明以上材料脫色率由大到小依次為：聚酰胺＞DM130＞S8＞HPD500＞HZ801＞AB8＞NKA2；多糖的保留率依次為：S8＞DM130＞聚酰胺＞HPD500＞AB8＞NKA2＞HZ801。從表中還可以看到，聚酰胺和大孔吸附樹脂都有一定的脫蛋白效果，其中聚酰胺對蛋白的去除率最高，約為26%，各種大孔吸附樹脂對蛋白的去除率相近，均在20%左右。雖然S8對多糖的保留率比聚酰胺高，但蛋白去除率和脫色率都不如聚酰胺高，因此宜選用聚酰胺脫色。

表1 聚酰胺和大孔吸附樹脂靜態脫色效果Table 1 Decolor effects of polyamide and macropore adsorptive

2.3.2 聚酰胺柱動態脫色效果

聚酰胺分子中存在眾多酰胺鍵，可與酚類、酸類、醌類、黃酮類等多種化合物形成氫鍵而吸附，在水中形成氫鍵的能力強，吸附強，在有機溶劑中則較弱，在酸性溶劑中強，堿性溶劑中最弱。利用上述性質可采用不同溶劑吸附，不同極性或pH的溶劑洗脫，即可達到脫色目的。由于茶多糖在堿性條件下不穩定，所以宜用去離子水先將不吸附組分洗脫，再用有機溶劑將各組分按氫鍵作用力由弱到強的順序梯度洗脫。常用的有機溶劑為乙醇。

去離子水可將大部分多糖與色素分離，但仍有部分多糖與聚酰胺結合緊密，需用高濃度乙醇將其洗脫。收集多糖含量較高的洗脫峰（圖3），真空濃縮的同時去除乙醇，冷凍干燥，得TPS1和TPS2。TPS1約回收了總多糖的60.3%，其純度由Sevag法脫蛋白后的49.8%提高到了70.2%，超過大多數市售茶多糖產品60%左右的純度，純化倍數為1.49。顏色由原來的深紅色變為淡黃色，TPS2約回收了總多糖的28%，仍含有大量色素。

實驗過程中還發現，將粗多糖配制成高濃度水溶液，室溫下放置3 d～4 d，產生了大量白色沉淀，測定結果表明該沉淀主要為蛋白質。推測是因為多糖干燥時，蛋白質和膠質等雜質發生了變性固化，當用水再次溶解，變性的蛋白質難以在水溶液中穩定存在。用該法先除去部分蛋白，再上聚酰胺柱脫色的同時脫蛋白，取得了良好的脫蛋白效果。

2.3.3 TPS1進一步脫色

李布青等將脫蛋白后的茶多糖用DEAE－纖維素柱分離，0.1 mol/L NaOH洗脫，獲得較純的茶多糖。許新德等也將粗老綠茶過DEAE－纖維素柱，得一中性多糖和3個酸性多糖[17]。但是本人在研究過程中也發現，用DEAE－纖維素柱分離脫蛋白后的茶多糖時，不僅大量色素被吸附在柱材料上，茶多糖也被大量吸附在柱材料上，用2.0 mol/L的NaCl溶液洗脫，仍不能將茶多糖大部分洗脫下來。洗脫下來的茶多糖脫鹽耗時也非常長。因此選用了Sephadex G50柱進一步純化茶多糖。

Sephadex G50分離多糖的相對分子量范圍為500～10 000，而所提取的茶多糖相對分子質量主要集中10 000左右，大部分能全排阻洗脫。圖4也表明茶多糖大部分多糖能全排阻洗脫，但仍有約10%的多糖難以與色素分離，推測這部分多糖可能與部分色素呈結合態。收集全排阻峰，用截留分子量為3 000的透析袋透析，冷凍干燥，得白色的TPS1－1。脫色率約為58%，蛋白去除率約為25%，多糖保留率約為88%，多糖的純度由70%提高到了89%，蛋白質含量由6.1%下降到4.5%。

3 結論

采用Sevag法脫蛋白、聚酰胺柱脫色、以及Sephadex G50進一步脫色的各步脫色率、純化倍數、純度、脫蛋白率和蛋白含量見表2。

從表2中可以看出，將含有蛋白和色素的粗多糖用Sevag法脫蛋白，3次可使蛋白含量由15%降低至11%，再經聚酰胺柱動態脫色，多糖純度大幅度提高，經Sephadex G50柱進一步脫色后，即可得到純度較高的多糖。因此，茶多糖的初步純化工藝可采用：Sevag法脫蛋白→聚酰胺柱脫色→SephadexG50進一步脫色。

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