ScYLV和SrMV的PCR引物優化設計

王洪星 ，張雨良 ，羅志文 ，楊文君 ，劉志昕

（1.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/農業部熱帶作物生物技術重點開放實驗室，海口 571101；2.海南大學環境與植物保護學院，儋州571737）

聚合酶鏈式反應（PCR）是體外擴增DNA的一種技術，其能夠在短時間內根據極微量的模板序列擴增出大量特異性DNA片斷，擴增過程類似于核裂變。Mullis博士在1983年發明了該技術，PCR技術是現代分子生物學中最有價值的技術之一（David Clark，2005），隨著科學技術的發展其又衍生出多種類型的相關技術，包括差異顯示PCR、實時定量PCR、巢式PCR、多重PCR和不對稱PCR等（薩姆布魯克，2002）。

PCR方法的廣泛應用及其相關技術的順利進行均離不開PCR引物的合理設計。可以說，PCR引物的合理設計是任何PCR反應能否進行及其產物的特異性、產率高低的關鍵。目前許多計算機軟件如Primer Premier 3.0，Primer Premier 5.0，Oligo 6.0等均可用于引物的設計。但由于軟件自身存在的局限性，其設計的引物并無法滿足實驗者不同需要。目前最常用的是計算機輔助設計，即實驗者根據PCR引物設計的原則并結合自己的經驗人工設計引物，然后選擇合適的軟件分析引物的合理性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及軟件

實驗用甘蔗樣品采自海南兩院甘蔗種植基地。 Trizol（Invitrongen），SYBR Green supermix（TaKaRa）、RTPCR試劑盒PrimeScript TM One-Step Ver.2.0購自寶生物工程（大連）有限公司，PCR產物回收試劑盒（上海生物工程有限公司），反轉錄酶、Taq酶及其它生物試劑均購自北京全式金生物科技有限公司，其它藥品為國產分析純。Primer Premier 5.0、Oligo6.0、DNAMAN等軟件于http://www.bio-soft.net下載。

1.2 甘蔗總RNA提取和RT-PCR

從待檢測甘蔗植株上取幼嫩組織，以TRIzol法（余愛麗，2004）得到較理想的RNA樣品。提取的總RNA溶解于100μL dd H2O中，取4μL RNA溶液稀釋200倍，采用UV-760紫外分光光度計測量260nm、280nm的OD值，計算OD260／280的比值并用1.2%的普通瓊脂糖凝膠電泳在約5V/cm的電壓下，快速電泳檢測并照相。

以所提取的總RNA為模板，利用寶生物工程 （大連）有限公司SuperScript III反轉錄體系進行，PCR反應按全式金公司TaqDNA聚合酶操作說明進行，并優化反應程序。

1.3 PCR引物的設計與目的序列測序

1.3.1 普通PCR引物設計與目的序列測序 根據甘蔗黃葉病毒 （ScYLV）genebank相關基因系列 （登錄號AF369923.1；AF369924.1；AF369925.1；AF369926.1；AF369927.1；AF369928.1；AF369929.1；AF141385.1；AF141385.1）、 高粱花葉病毒 （SrMV） 相關基因序列 （登錄 號：NC_004035.1；DQ530434.1；U57358.2；AY648298.1）通過DNAMAN軟件比對，找出保守序列，綜合考慮引物設計的各項原則，運用DNAMAN、Primer Premier 5.0和Oligo6.0進行基因同源性分析和引物設計，使引物序列G+C含量介于45%～60%，引物長度介于18～25bp，目的片段介于400～1000 bp（見表1）。

對PCR的各引物濃度及反應的退火溫度進行優化，篩選出不同病毒PCR反應體系的最佳反應模式。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳；切膠后用回收目的片段，克隆于pMD18-T載體，送上海生物工程公司測序。

1.3.2 多重PCR引物設計擴增 利用上述結果，結合考慮多重PCR引物設計的各項原則，運用Primer Premier 5.0和Oligo6.0進行引物驗證，以挑選出一對特異引物（表1）。

1.3.3 實時定量PCR引物設計 綜合考慮多重PCR引物設計的各項原則， 運用 Primer Premier 5.0、Oligo6.0和DNAMAN進行基因同源性分析和引物設計。對PCR的各引物濃度及反應的退火溫度進行優化，篩選出PCR反應體系的最佳反應模式（表2）。切膠回收，測序；連接pMD18-T載體、轉化、提取質粒，稀釋10倍，利用SYBR Green I熒光染料法做標準曲線。

表2 用于實時定量PCR擴增的引物特征

1.4 帶有酶切位點的引物設計與目的序列測序

根據ScYLV相關基因 （登錄號AY23679.1、GU190159.1、HM640267、AF157029.1、AF369927.1、GU190159.1、AF157029.1、AM072750.1、AY236971.1、GU570006.1），綜合考慮酶切位點引物設計的各項原則，運用Primer Premier 5.0、Oligo6.0和DNAMAN進行基因同源性分析和引物設計，設計出克隆Coat Protein（CP）基因和P0蛋白基因的引物（表3）。

對PCR的各引物濃度及反應的退火溫度進行優化，篩選出不同基因片段PCR反應體系的最佳反應模式。切膠回收、雙酶切，連接pMD18-T載體、轉化、提取質粒，雙酶切質粒，凝膠電泳，回收目的片段，再送檢測序。

表3 用于擴增ScYLV相關序列的帶酶切位點的引物特征

2 結果與分析

2.1 樣本總RNA電泳結果

用TRIzol法分別從感病植株葉片中提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳顯示各條帶清晰，無明顯的拖尾現象，RNA具有較好的完整性（圖1）。

圖1 Trizol法提取甘蔗病葉總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳

2.2 PCR引物效果檢測

2.2.1 普通PCR引物效果檢測 所設計PCR引物擴增效率高、特異性好、電泳結果呈單一亮帶，且各引物無特異性條帶，引物設計成功。ScYLV和SrMV均見特異性反應條帶，經測序，1～5的條帶大小依次為：833、470、591、400、346 bp，與預期產物大小相同（圖 2）。

圖2 引物特異性試驗

圖3 多重RT-PCR特異性試驗

2.2.2 多重PCR引物設計效果檢測 特異性試驗ScYLV和SrMV均見特異性反應條帶，而且引物之間與模板之間也未產生明顯的相互干擾，引物設計成功。經測序，序列大小分別為346和833bp，與預計產物大小相同（圖3）。

2.2.3 實時定量PCR引物設計效果檢測 試驗以制備的ScYLV標準品 （濃度分別為 108、107、106、105、104、103、102、101）采用10倍濃度的梯度稀釋。通過梯度稀釋樣本的設置，用擴增曲線達到域值時的反應循環數（Ct值）做回歸曲線，結果如圖4：可以得到較理想的標準曲線，線性關系良好 （R2=0.988），擴增效率為99.8%，引物設計成功，可以定量檢測ScYLV。

圖4 ScYLV熒光定量標準曲線

圖5 PMD-19重組質粒的酶切圖譜

2.3 帶有酶切位點的引物設計效果檢測

PCR產物經雙酶切后的電泳結果 （圖5）表明，所設計引物擴增效率高、特異性好，可用于后續試驗。ScYLV CP、P0可以順利克隆表達，經測序，條帶大小分別為591 bp和771 bp，與預期產物大小相同，均成功連有酶切位點，經蛋白分析后，CP基因在表達載體中表達出來的融合蛋白大約43kD；P0基因在表達載體中表達出來的融合蛋白大約51 kD。

3 討論

PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的寡核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優劣直接關系到PCR的特異性成功與否。設計PCR引物，首先要解決引物評估問題，即回答什么是合適的引物，以及這些引物的相互干擾是否在可接受的范圍內。PCR引物設計問題中要考慮的生物參數分為兩部分：首先是先確定單個引物的約束參數，據此可以區分引物的優劣；其次是根據不同PCR的要求確定引物間的約束參數，據此來評價引物之間的干擾是否在可接受的范圍內。

表4 單條引物約束參數

3.1 普通PCR引物的約束參數

根據對文獻的總結，對單個引物考慮了如下 11個約束條件 （表 4）： 引物長度（Abdelsalam.K.,2003 ）、Tm 值（SantaLucia.J.Jr.,1998）、引物 GC 含量（Dieffenbach.C.W.等，1993）、引物自身二聚體、二級發夾結構、寡核苷酸長度、3'端穩定性（Steven.Rozen，2007）、GC 夾（F.John.Burpo，2001）、3'端自互補、互補性、特異性（Lin.W.M.，1993）。

3.2 多重PCR的引物約束參數

在多重PCR反應中，引物的設計至關重要，是影響多重PCR反應成敗的關鍵。在多重PCR反應中，單條引物的長度最好介于18～24 bp，引物太長，容易導致引物之間相互纏繞，嚴重影響多重PCR反應結果。同時，為了避免引物的非特異性擴增，引物必須高度特異。此外，要充分考慮到不同引物對之間互補的堿基序列，特別是引物間引物二聚體的形成，這將嚴重影響到引物的有效性。所有的引物對最好有相近的退火溫度，引物的堿基構成最好是4種堿基的比例相當，G+C的含量最好介于40%～60%。如果可能的話，引物的序列以1～2個GC開頭或結尾，避免3'端以A結尾。將引物設計好后，設計的引物序列應該與數據庫中的核苷酸序列進行比對。如果擴增位點非常相似，存在著交叉反應，那么在引物的3'末端至少有1～2個特異性的堿基用于目的基因的特異性擴增。在多重PCR反應中，引物的濃度影響著多重PCR反應的結果。試驗結果證明，太高的引物濃度或者太低的引物濃度在多重PCR的反應中都應該避免（Henegariu.O.，1997）。太高的引物濃度或許抑制了多重的反應結果，同時太低的引物濃度很可能是無效的。

根據（Peter.M.V，2004）對多個引物之間，以及引物對，考慮了如下7個約束條件（表5）：引物長度差、退火溫度差、引物間3'端互補、產物長度、產物間長度差、引物間互補、特異性。

表5 用于多重PCR引物約束參數

3.3 實時定量PCR引物約束參數

對于實時定量PCR有兩種類型：（1）染料法。一般用SYBRGreenⅠ染料較為常見，其引物設計參數根據（Moravec.T，2003），引物設計的基本原則是提高擴增的效率和檢測特異性。一般遵循以下原則（表6）。（2）熒光探針檢測法。要同時考慮引物和探針的質量。通常先滿足普通PCR引物的設計要求，然后尋找合適的探針位置，再進行探針的設計，然后再將引物和探針之間進行比對分析（Kalender，2008）。用于實時定量PCR探針技術指標如表6。

表6 用于SYBR GreenⅠ染料法和探針法實時定量PCR引物約束參數

表7 帶有酶切位點的引物約束參數

3.4 帶有酶切位點的引物約束參數

對于帶有酶切位點的引物設計，考慮了6個約束條件（表7）：酶切位點、目的序列、酶切位點的位置、酶切效率、引物長度、特異性。一般都是做基因克隆表達，除基本滿足一般的引物要求外還有更高的要求。根據實驗需要，確定需要擴增的DNA序列，并知道其CDS區序列（編碼結構基因區，即從起始密碼子區至終止密碼子區）可登陸NCBI網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢。

3.5 影響引物設計成功率的因素

引物設計的優劣，是影響實驗結果的重要因素。有些引物反應性能差，可以通過反應條件優化得到改善，但大多數情況改善的效果并不明顯，因此，預先設計反應性能好的引物非常重要。針對引發PCR實驗失敗的三大主要因素（Andreson.R.，2008）：（1）引物和模板結合位點數目；（2）引物 GC 含量；（3）預期 PCR 擴增產物。引物設計的關鍵點主要有三：（1）特異性高：DNA模板上不存在與引物的錯配部位或錯配效率較低；（2）對引物解鏈溫度Tm值的精確估算是確定PCR反應退火溫度的前提條件，決定著實驗的效率和精確性（Chavali.S，2005）。因此Tm值和GC含量在適當范圍；引物利用效率高：引物內部和上、下游引物之間無互補序列；（3）引物的長度、擴增片段長度等參數也要加以考慮。

引物設計主要借助于生物軟件，如：Primer3（Rozen.S.，2000）,Primerpremier （Singh.V.K，1998），0ligo（Rychlik.W,2007）等，但其重點在單引物的設計優化上，當中也有個別引物設計軟件考慮到了引物之間設計優化，基于不同實驗要求，引物設計中，由于實驗的復雜性，幾乎沒有某一個引物設計軟件能完美地完全滿足要求。因此利用引物設計軟件中不同技術指標參數。再加上人為的分析和選擇因素不但可以大大提高引物設計的成功率，而且可以不必花費太多時間和精力。經實驗總結可以歸納一下，主要有以下三點：第一，模板的因素。盡量避免選擇一些困難模板，其中有一些模板本身的GC含量偏高或偏低，導致引物的GC含量不能控制在合適的范圍。另外還有一些模板基因家族很大或者與其DNA序列相近的基因很多，導致引物的PCR擴增不特異。這些最終都造成PCR擴增的失敗；第二，引物的篩選，運用Primer Premier 5.0設計了一組引物后，經過初次篩選得到幾對適合要求的引物，還要在初次篩選的基礎上進一步用Oligo6.0驗證，然后篩選出能夠進行特異高效PCR擴增的引物。

選出理論上較合適的引物以后，可以有以下兩個步驟，保證引物設計的成功率：一是要將得到的一系列引物分別在Genebank中進行回檢。也就是把每條引物在比對工具http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/的blast中進行同源性檢索，棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物，也就是有可能形成錯配的引物。一般連續10bp以上的同源有可能形成比較穩定的錯配，特別是引物的3'端應避免連續5～6bp的同源。二是如果以mRNA為模板設計引物時還應注意：首先利用生物信息學的知識大致判斷外顯子與內含子的剪接位點 （例如http://CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html的GENES-CAN工具或者GeneParser軟件），然后棄掉正好位于剪接位點的引物，實驗證明，按照上述原則設計合成的引物和探針，得到了高擴增效率和穩定的檢測結果。

引物設計只是為PCR反應提供一種可能性，實驗中由于影響PCR實驗的因素較多，有時需要不斷摸索條件，引物設計軟件只是一種工具，只能為PCR實驗設計提供比較可靠的引物，加速最佳條件的摸索，最終達到成功實現PCR實驗的目的。

[1]Andreson.R.，Mols.T.，Remm.M.Predicting failure rate of PCR in large genomes[J].Nucleic Acids Res，2008，36（11）：66-67.

[2]Abdelsalam.K.Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design[J].African Journal of Biotechnology， 2003，2（5）：91-95.

[3]Chavali.S.，Mahajan.A.，Tabassum.R.，Bharadwaj.D.， Oligonucleotide properties determination and primer designing：a critical examination of predictions.[J].Bioinformatics，2005，21（20）：3918-3925.

[4]Dieffenbach.C.W.，Lowe.T.M.，Dveksler.G..S.General concepts for PCR primer design[J].PCR Methods and Appl.，1993，3（3）：30-37.

[5]David Clark.Molecular Biology：Understanding the Genetic Revolution[M].U.S.A：ELSEVIER Inc.，2005：52-73，634-661.

[6]F.John.Burpo.A critical review of PCR primer design algorithm and cross-hybridization case study[Z].USA：Stanford University，2001：1-11.

[7]Henegariu.O.，Heerema.N.A.，Dlouhy.S.R.，et al.Multiplex PCR：critical Parameters and Step-by-Step Protocol[J].Biotechniques，1997，23（3）：504-511.

[8]薩姆布魯克J，拉塞爾D W（黃培堂等譯）.分子克隆實驗指南（第3版）[M].北京：科學出版社，2002：597-701.

[9]Kalendar R.L.D.,Schulman A.H.FastPCR Software for PCR Primer and Probe Design and Repeat Search[J].Genes，Genomes and Genomics，2009，3（1）：1-14.

[10]林萬明.PCR技術操作與應用指南[M].北京：人民軍醫出版社，1993：25-40.

[11]Moravec.T.，Cerovska.N.，Boonham.N.The detection of recombinant，tuber necrosing isolates of Potato virus Y（PVY（NTN））using a three-primer PCR based in the coat protein gene[J].J.Virol.Methods，2003，109（1）：63-68.

[12]Peter.M..V.，John.M.Butler.AutoDimer：a screening tool for primer-dimer and hairpin structures[J].BioTechniques，2004，37（2）：226-231.

[13]Rozen.S.，Skaletsky.H.Primer3ontheWWWforgeneralusersandforbiologistprogrammers[J].MethodsMol.Biol.，2000，132：365-386.

[14]Rychlik.W.OLIGO7 primer analysis software[J].Methods Mol.Bio.，2007，402：35-60.

[15]SantaLucia.J.，Jr.A unified view of polymer，dumbbell，and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（4）：1460-1465.

[16]Steven.Rozen.，Helen.Skaletsk.Primer3 Input Help[Z].USA：Whitehead Institute for Biomedical Research，MIT，2007.

[17]Singh.V.K.，Mangalam A.K.，Dwivedi.S.，Naik.S.Primer premier program for design of degenerate primers from a protein sequence[J].Biotechniques，1998，24（2）：318-319.

[18]余愛麗.斑茅抗逆性評價及其BADH基因的克隆表達[D].福建農林大學，2004：27-28.