MMP-7蛋白在肺癌患者和正常人外周血中的表達水平及臨床意義

孫小亮 肖汀 楊磊 高燕寧 程貴余 孫克林

最新統計數據[1]顯示，肺癌已成為美國男性和女性發病率第二位的惡性腫瘤，死亡率居各惡性腫瘤之首，成為嚴重危害人類健康的疾病之一。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌最常見的類型，占肺癌的85%，但5年生存率卻僅為15%。70%的肺癌患者在確診時已屬晚期，失去了手術機會[2]。如果肺癌患者能早期診斷，5年生存率可達80%[3]。基質金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase 7, MMP-7）又稱基質溶解素，是MMPs家族成員之一，具有一定的底物特異性，主要作用于細胞外基質、基底膜及細胞膜表面分子等，它可在人體正常上皮細胞中表達，但活性非常低。MMP-7的過表達發生于各種上皮來源的腫瘤及間質腫瘤，其過表達與腫瘤細胞的發生、浸潤、轉移和復發等密切相關[4]。

目前，肺癌組織中MMP-7蛋白表達情況的檢測國內外有較多的報道，血清中MMP-7的RNA檢測近來也有少量報道，但尚未見關于外周血血漿中MMP-7的蛋白水平的研究，本研究旨在通過雙抗體ELISA夾心法檢測肺癌患者和正常人外周血血漿中MMP-7的蛋白水平，以探討其是否可以作為肺癌的腫瘤標志物及其與肺癌的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 實驗組為2010年3月-2011年5月在中國醫學科學院腫瘤醫院確診的肺癌患者114例。入組標準：①經支氣管鏡活檢、細胞學或術后病理證實為肺癌患者；②未接受過放化療治療；③無嚴重肺間質性疾病。根據世界衛生組織（World Health Organization, WHO）2004年的肺癌組織學分型標準進行肺癌組織學分型，根據國際抗癌聯盟（International Union Against Cancer, UICC）2009年發布的第7版肺癌TNM分期系統進行肺癌分期。114例肺癌患者包括男性77例，女性37例；中位年齡60歲（38歲-78歲）；既往有吸煙史65例，無吸煙史49例；腫瘤直徑≤3 cm 53例，＞3 cm 61例；鱗癌42例，腺癌52例，小細胞肺癌10例，其它（類癌、支氣管內粘液表皮樣癌、非典型類癌）3例，無明確病理類型7例；低分化38例，中分化47例，高分化8例，無明確分化21例；無淋巴結轉移40例，有淋巴結轉移59例，淋巴結轉移不詳15例；I期+II期61例，III期+IV期53例。詳細臨床資料見表1。

對照組為中國醫學科學院腫瘤醫院防癌科體檢的100例性別和年齡匹配的正常人群，既往均無嚴重肺間質疾病。

1.2 ELISA方法 用EDTA抗凝管采肺癌患者空腹靜脈血，置4oC冰箱暫存，2 h內送實驗室，經低溫離心（1,500 rpm, 4oC, 10 min）分離，取上層血漿分裝后保存-80oC冰箱待檢。對照組正常人的外周血樣品由中國醫學科學院腫瘤醫院防癌科提供。應用ELISA雙抗體夾心法檢測外周血血漿中MMP-7蛋白水平（按照MMP-7 ELISA KIT[美國R&D公司，貨號為SMP700]說明書進行）。操作步驟如下：從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4oC冰箱；標準蛋白濃度：標準品（S0-S8）濃度依次為0 ng/mL、0.156 ng/mL、0.312 ng/mL、0.625 ng/mL、1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL。樣本孔先加樣本稀釋液25 μL，再加待測樣本25 μL，標準品孔加50 μL標準品，空白孔加PBS液，置于水平振蕩器（500±50）rpm室溫孵育2 h。洗板去除多余樣品，1×PBST緩沖液洗板4次。加酶標抗體：每個反應孔加200 μL，置于水平振蕩器室溫孵育2 h。洗板去除多余抗體，1×PBST緩沖液洗板4次。顯色：每個反應孔中分別加入200 μL新鮮配置的顯色液（A+B），室溫避光反應30 min。終止反應：每個反應孔加入終止液50 μL，終止反應。在酶標儀上于450 nm處測定各孔的OD值。標準曲線的建立：分別以濃度為0、0.156 ng/mL、0.312 ng/mL、0.625 ng/mL、1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL的MMP-7標準蛋白為S0-S8標準點，檢測其OD值，以S0點為空白對照，以S0-S8標準品的濃度為橫坐標，相應的OD值為縱坐標，制作出標準品線性回歸標準曲線，求得標準曲線公式及相關系數，根據公式計算相應標準品的濃度值（ng/mL）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。計量資料進行正態性檢驗，不符合正態分布的數據進行非參數檢驗（Mann-Whitney U test），符合正態分布的數據進行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌患者與正常人外周血血漿中MMP-7的蛋白水平 肺癌患者外周血血漿中MMP-7蛋白濃度（n=114, median=0.72 ng/mL）明顯高于正常人外周血血漿中MMP-7蛋白濃度（n=100, median=0.30 ng/mL），兩組之間差異有統計學意義（Z=-6.649，P＜0.001，圖1）。

2.2 肺癌患者外周血血漿中MMP-7的蛋白濃度與肺癌患者臨床特征的關系 將肺癌患者按照臨床特征分組，分別比較各組間MMP-7蛋白濃度的差異，結果（表1）提示：年齡（≤60歲和＞60歲）、性別（男和女）、吸煙史（有和無）、腫瘤大小（≤3 cm和＞3 cm）、病理類型（鱗癌、腺癌、小細胞肺癌等）、淋巴結轉移（有和無）及分期（I期+II期和III期+IV期）各組的肺癌患者外周血血漿中MMP-7蛋白濃度差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 以血漿中MMP-7濃度作為診斷標準的診斷效能 采用血漿中MMP-7濃度區分肺癌病例和正常人群時，接受者操作特性曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）的曲線下面積（area under the ROC curve, AUC）為0.764，當cutoff值定為0.56 ng/mL，MMP-7檢測肺癌的敏感性為62.3%，特異性為76.0%（圖2）。

3 討論

進入21世紀以后，肺癌已經超過胃癌和肝癌成為我國惡性腫瘤死因的第一位[5]。2005年我國肺癌新發病例數為536,407人，死亡病例數475,768人，年平均增長1.63%[6]，早期肺癌經積極治療，5年生存率可達60%以上，但肺癌的總體5年生存率卻低于15%，主要原因是肺癌發病隱匿，多數在診斷時已屬晚期。因此，研究肺癌的生物學特性對肺癌的診治顯得尤為重要。

基質金屬蛋白酶（MMPs）是一類具有Zn2+依賴性的內源性蛋白水解酶，幾乎能降解除多糖外細胞外基質的所有成分。自1962年Gross等人首先發現第一種間質膠原酶并命名為MMP-1后，至今在MMP家族中至少已發現25個成員[7]。MMP-7是一種分泌型蛋白，由Sellers和Woessner于1980年在大鼠子宮中發現，1988年第一次成功克隆出人的同源基因[8]。人類MMP-7基因定位于11q21-q22，與MMPs家族其它MMP相比較，MMP-7分子量只有28 kDa，是目前所發現的相對分子質量最小的MMPs。MMP-7在消化道腫瘤的進展期存在過表達現象，如食管[9]、胃[10]、結腸[11]、肝[12]和胰腺[13]。Liu等[14]研究了MMP-7在人類肺腺癌A549細胞系中的表達及作用，提示MMP-7與肺癌細胞增殖、凋亡相關。

本研究通過ELISA法檢測114例肺癌患者和100例正常人外周血血漿中MMP-7蛋白水平，證實肺癌患者外周血血漿中MMP-7蛋白水平明顯高于正常人外周血血漿中MMP-7蛋白水平（P＜0.001），當cutoff值為0.56 ng/mL時，MMP-7檢測肺癌的敏感性為62.3%，特異性為76.0%，說明MMP-7可能成為一種輔助肺癌診斷的腫瘤標志物，并有希望成為一種新的肺癌治療的靶向藥物的靶標。但因MMP-7表達于各種上皮來源的腫瘤及間質腫瘤，無特異性，故目前尚無證據表明其可以早期診斷肺癌。況且，肺癌的早期診斷是一項重大的挑戰，尤其是單一標志物更難以做到。

目前，已有多項研究[15-17]報告證實肺癌組織中MMP-7的表達明顯高于正常肺組織，且肺癌組織中MMP-7的表達與腫瘤的分化、淋巴結轉移、分期及預后等密切相關，但也有研究[18]表明肺癌組織中MMP-7的表達與腫瘤的淋巴結轉移及分期等無關。但尚未見有肺癌患者外周血中MMP-7蛋白水平與腫瘤分化、淋巴結轉移及分期等生物學特性的相關文章報道。本研究通過ELISA法檢測肺癌患者外周血中MMP-7蛋白濃度，然后根據肺癌的生物學特性進行分組分析，結果表明肺癌患者外周血中MMP-7蛋白濃度與肺癌患者的年齡、性別、有無吸煙史、腫瘤大小、病理類型、淋巴結有無轉移及分期均無明顯相關性，分析原因可能為：①樣本量的限制；②目前尚無證據證明肺癌組織中MMP-7表達與外周血中MMP-7蛋白水平有一致性；③外周血中的腫瘤標志物僅具有輔助診斷的作用，與腫瘤的生物學特性本來就沒有直接的關系（目前已被臨床廣泛接受并應用的外周血PSA、AFP等標志物可以輔助甚至早期診斷前列腺癌、肝細胞肝癌等，但臨床已證實其濃度與腫瘤的生物學特性無相關性）。因此，尚需要更進一步大樣本的臨床研究證實。

圖 1 肺癌患者和正常人外周血中MMP-7蛋白濃度Fig 1 MMP-7 concentrations in lung cancer patients and normal controls

圖 2 采用血漿中MMP-7濃度區分肺癌患者和正常人的ROC曲線Fig 2 The ROC curve of MMP-7. ROC: receiver operating characteristic curve.

表 1 肺癌患者外周血中MMP-7蛋白濃度Tab 1 The results of MMP-7 concentration in lung cancer patients