C1煙煤中自然產出的納米二氧化硅對BEAS-2B細胞的體外毒性

李光劍 黃云超 劉擁軍 郭律 周永春 楊堃 陳穎 趙光強 雷玉潔

中國云南省宣威地區（包括宣威、富源、麒麟和沾益等）（E 103°35′30″-104°49′48″, N 25°02′38″-26°44′50″），位于中國西南部，該地區擁有人口約310萬，95%為農村居民，是世界非吸煙女性肺癌發病率最高的地區之一，甚至在宣威縣的來賓鎮，女性肺癌發病率高達400/100,000，是全國平均水平的20倍[1-3]。

宣威地區女性肺癌高發病率受到國內外眾多學者的關注，最近的研究[4,5]表明，宣威地區女性肺癌高發可能與當地開采和使用的C1煙煤及其燃燒產物（底灰和煙塵）中含有的大量超細二氧化硅顆粒物緊密聯系。1996年國際癌癥研究機構（International Agency For Research On Cancer,IARC）將石英（結晶型二氧化硅）規定為人類第一類致癌物質，相關研究也支持石英是一種肺部致癌物質[1]，這些研究成果主要來自于對工業場所和職業環境暴露（如：噴砂、陶瓷工人、水泥制造、采石、建筑工人等）二氧化硅研究后獲得。中國云南省宣威地區非吸煙女性肺癌可能是自然暴露（室內燃煤空氣污染）二氧化硅后形成肺癌的良好模型。因此，從C1煙煤燃燒產物中分離天然產出的納米二氧化硅顆粒物，分析這些顆粒物的粒徑分布、表面特征和顯微組分依存關系，研究這種自然產出的納米二氧化硅是否比已知的有毒顆粒物（工業生產的納米二氧化硅和結晶型二氧化硅）具有更高的體外細胞毒性，能為納米二氧化硅致肺癌發生的假說提供理論支持，為納米顆粒物毒性研究提供重要參考數據。

1 材料與方法

1.1 C1煙煤燃燒后底灰中的納米二氧化硅分離與表征

1.1.1 獲取C1煙煤底灰樣品 煙煤取自宣威縣來賓鎮老林煤礦和雁塘煤礦，當地人群肺癌發病率非常高，共20份，每份為1 kg。在可控氣氛的管式電爐中進行灰化，把氮氣和氧氣預先混合（4:1的比例），將爐內溫度加熱至1,100oC，獲得實驗室煙煤燃燒后的高溫灰化樣品。

1.1.2 C1煙煤底灰中的納米二氧化硅分離 取約2 g底灰溶于8 mL的四氫呋喃溶液（Tetrahydrofuran, THF/杭州四季青公司）中，超聲波浴缸中震蕩（FS-60H, 130 W, 20 kHz,Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA）約30 min，再加入六偏磷酸鈉2 g（分散凝聚的細小顆粒），再次超聲波震蕩約10 min，靜置2 h，待出現沉淀物后取上清液在高速離心機（H1650-W型/Xlang Yi有限公司)上離心（＞12,000轉，持續約10 min），去除上清液后自然風干，取沉淀物進行鑒定。

1.1.3 二氧化硅顆粒物表征 掃描電鏡（scanning electron microscopy, SEM）觀察分離出的顆粒物形態及大小，用配帶的能譜儀（Energy Dispersive X-ray analyzer, EDX）分析其顆粒物的顯微組分；馬爾文激光粒度分析儀分析顆粒物的粒徑分布（將0.1 g的顆粒物溶于95%乙醇中，超聲波浴缸中震蕩分散顆粒物后上機分析。該儀器分析范圍為0.02 μm-2,000 μm，數據導出后在Excel表中得到分布曲線）；透射電子顯微鏡（transmission electron microscope, TEM）觀察單顆粒形貌特征，配帶的能譜儀分析單顆粒賦存的顯微組分。

1.2 人正常支氣管上皮細胞 ΒEAS-2Β細胞株由昆明醫科大學臨床腫瘤學院腫瘤研究所提供，該細胞系主要用于篩選誘導或影響分化及致癌的化學或生物制劑。

1.3 主要化學試劑和儀器 四氫呋喃溶液、95%酒精、胎牛血清（杭州四季青生物公司），工業生產的50 nm二氧化硅、結晶型二氧化硅（Min-U-Sil 5）（U.S. Silica Company,Βerkeley springs. Wv, USA）；色譜級正丁醇、乙腈、分析級1,200萬鹽酸、胰蛋白酶（Pittsburgh, PA, USA）；Hank's平衡鹽溶液（Carlsbad, CA, USA）；磺酰羅丹明Β，三氯乙酸（Irvine, CA, USA）；1,1,3,3-四甲氧基丙烷、硫代巴比妥酸、2 -吡啶、2',7'-二氯熒光素二脂（上海富眾儀器有限公司）；L-絲氨酸、硼酸、二亞乙基三胺五乙酸（97%）（上海安譜科學儀器公司）；鹽酸三氯三乙胺、丁基羥基甲苯、 醋酸和磷酸二鈉（北京華爾博科技公司）。QUANTA200型掃描電子顯微鏡（Philips Company, Holland），OXFORD型透視電子顯微鏡鏡（Oxford, US）， Phoenix+DIM一體化能譜及電子背散射衍射儀（EDAX Company, USA），Sartorius電子天平（Sartorius, Germany），高機能馬弗爐FP310（YAMATO company, Japan），馬爾文激光粒度分析儀（Malvern Instruments Ltd., USA），NOVA2000e型ΒET氮吸附比表面積儀（Quantachrome instruments Ltd/USA）。

1.4 細胞培養和二氧化硅處理 ΒEAS-2Β細胞復蘇后用含10%胎牛血清的Hams F-12（含L-谷氨酰胺）培養基中培養，培養基中加入100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素，在37oC、5%CO2培養基中孵化。取對數生長期的ΒEAS-2Β細胞接種于96孔培養板中，5×104個細胞/孔。每組設3個復孔，待細胞貼壁48 h后加入刺激物懸浮液共同培養。共設3個處理組，宣威組（C煙煤中自然產出的二氧化硅）、50 nm工業生產的二氧化硅組和結晶型二氧化硅組（Min-USil5），其基本特征見表1。

1.5 細胞成活率的測定 應用3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, Mヰ）比色法檢測經處理后的ΒEAS-2Β細胞成活率變化。

1.6 細胞毒性檢驗 細胞內活性氧化酶（reactive oxygen species, ROS）的測定：細胞內活性氧化酶通過2',7'-二氯熒光素二乙酸酯方法測量（2',7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA），DCFH-DA進入細胞內和細胞內活性氧化酶結合形成熒光化合物二氯熒光素二乙酸酯。具體方法是：10 mM的DCFH-DA原液用Hank's平衡鹽溶液稀釋500倍后作為工作液備用，待刺激物和ΒEAS-2Β細胞共同培養24 h、48 h和72 h后用Hank's平衡鹽溶液洗滌2次，將洗滌后的細胞在2 mL的工作液中37oC孵育30 min。熒光素通過酶標儀（Thermo Scientific Microplate Reader/USA）在485 nm和525 nm波長處測定。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）水平測定：乳酸脫氫酶水平根據商業試劑盒操作指南進行測量（Pointe Scientific, Inc, Lincoln Park, MI, USA）。

1.7 統計學分析 用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學處理。每個實驗重復3次，每次實驗設3個復孔，所得數值采用Mean±SD表示，組間比較采用兩樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C1煙煤底灰中分離出的納米二氧化硅顆粒物與表征C1煙煤燃燒后底灰中出現大量的游離微米級和納米級二氧化硅顆粒物，呈纖維狀或球形，賦存有鈣、鐵等元素（圖1）。底灰經反復多次分離后，可獲得純度較高的二氧化硅顆粒物，粒徑分布多數為納米級，少數為微米級，呈球形或不規則貌，與底灰中的二氧化硅顆粒物相比，其形貌未發生改變，分散較好，無明顯團聚現象。能譜分析發現，二氧化硅顆粒物同時賦存少量的鋁、鈣、鐵等元素（圖2），使用馬爾文激光粒度分析儀進行顆粒物粒徑分布分析，在可測量的范圍內，發現30 nm-120 nm范圍內的二氧化硅顆粒物占86.8%（圖3）。

通過透射電子顯微鏡進行單顆粒形態分析，發現這些顆粒物表面不光滑，形態不規整，少數呈纖維狀，單顆粒主要成分為硅元素，賦存有鋁、鐵和錳等元素（圖4）。

表 1 二氧化硅顆粒物表征Tab 1 Characterization of the silica particles

圖 1 C1煙煤燃燒后底灰中的纖維狀微米級二氧化硅顆粒物（A）和球形納米二氧化硅顆粒物（B），能譜分析發現賦存有鈣、鐵等元素（C）。Fig 1 The fibrous silica micronparticles (A) and spheral silica nanoparticles (B) in C1 coal ash, and containing traces of iron and calcium(C).

圖 2 底灰中分離出的二氧化硅顆粒物形態及能譜分析，賦存鈣、鐵和鋁元素。Fig 2 The picture of silica particles separated from coal ash and the EDX analysis, containing traces of iron, calcium and aluminum.

圖 3 激光粒度分析結果，分離出的二氧化硅顆粒物主要分布在30 nm-120 nm之間。Fig 3 Particle size analysis by laser particle size analyzer, the silica particles are mainly distributed from 30 nm to 120 nm.

圖 4 底灰中分離出的二氧化硅單顆粒形貌，表面不光滑，形貌不規則，賦存有鋁、鐵和錳元素。Fig 4 The morphology of single silica nanoparticles separated from coal ash, have irregular surface area and containing traces of iron,calcium and manganese.

2.2 ΒEAS-2Β細胞成活率變化 將0.1 g分離出的二氧化硅顆粒物溶于100 mL超純水中，在超聲波浴缸中震蕩，配制成1 mg/mL的懸浮溶液為實驗組（宣威組）。設相同濃度工業化生產的50 nm二氧化硅組、結晶型二氧化硅（Min-USil 5）組和空白組為對照。待細胞貼壁48 h后，在培養基內分別加入配制的懸浮溶液，使刺激濃度分別達10 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL。共同培養48 h后，應用Mヰ法檢測細胞成活率變化情況。當刺激濃度為10 μg/mL時，與空白組相比，宣威組、50 nm二氧化硅組和結晶型二氧化硅組的細胞成活率分別為88.7%、89.1%和94.9%，宣威組的細胞成活率下降與結晶性二氧化硅組相比有差異（P=0.036,7）；當二氧化硅刺激濃度為50 μg/mL時，其各組的細胞成活率分別為76.6%、87.6%和90.2%，宣威組的細胞成活率下降與50 nm二氧化硅組和結晶型二氧化硅組相比均有明顯差異（P=0.007, P=0.001）；當刺激濃度為100 μg/mL時，各組的細胞成活率分別為57.3%、72.5%和78.7%，宣威組的細胞成活率下降與50 nm二氧化硅組和結晶型二氧化硅組相比均有明顯差異（P＜0.05）（圖5）。雖然各組的細胞成活率均隨二氧化硅刺激濃度的增加而下降，但以宣威組細胞成活率下降最為明顯，其主要原因可能是在相同的質量下，從宣威煙煤燃燒底灰中提取的自然產出的二氧化硅顆粒物因形態不規則而具有較大的表面積，而顆粒物的表面積是影響其生物活性的最主要因素[6-9]。

2.3 二氧化硅顆粒物對ΒEAS-2Β細胞的體外毒性 待細胞貼壁48 h后，在培養基內分別加入配制好的懸浮溶液，使刺激濃度達100 μg/mL，待刺激培養基中的ΒEAS-2Β細胞24 h、48 h和72 h后，測得各組ΒEAS-2Β細胞的乳酸脫氫酶（LDH）水平逐漸升高，在相同時間點上，以宣威組細胞升高最為明顯，與空白對照組相比分別升高了3.4%、9.2%和18.8%，結晶型二氧化硅組和50 nm二氧化硅組分別上升2.7%、3.8%、4.1%和5.2%、7.9%、10.3%。宣威組和結晶型二氧化硅組相比，在刺激48 h時，乳酸脫氫酶（LDH）升高有差異（P=0.027），在刺激72 h時有明顯差異（P=0.001），與工業生產的50 nm二氧化硅組相比在各時間點均無明顯差異。細胞培養基中的乳酸脫氫酶水平升高，提示存在細胞膜損傷，且上升越明顯其細胞膜損傷越嚴重[10]。宣威煙煤燃燒后底灰中提取的自然產出的二氧化硅顆粒物因形態不規則，表面不光滑，部分呈纖維狀而更容易穿透細胞膜而造成細胞膜損傷。因此，在相同的刺激時間、刺激濃度和相近的粒徑下（50 nm組），宣威組的乳酸脫氫酶升高最明顯（圖6）。

細胞內活性氧化酶（reactive oxygen species, ROS）通過二氯熒光素（dichlorofluorescin, DCF）熒光強度來表示，DCF熒光強度隨二氧化硅刺激時間的延長而增加。與空白組相比，當刺激時間為24 h時，宣威組的熒光強度增加了37.4%，與結晶型二氧化硅組增加的16.6%相比有差異（P=0.047,2）；當刺激時間為48 h時，宣威組的熒光強度增加了48.1%，與結晶型二氧化硅組增加的26.8%相比有明顯差異（P＜0.001），與50 nm二氧化硅組增加的30.1%相比有差異（P=0.031,2）；當刺激時間為72 h時，宣威組的熒光強度增加了70.5%，與50 nm二氧化硅組增加的48.9%和結晶型二氧化硅增加的41.2%相比均有明顯差異（P＜0.001,P=0.001）（圖7）。ROS是細胞代謝活化過程中產生的一系列活性氧簇，ROS的氧化能力強，廣泛參與胞內信號的傳遞，能激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）通路和轉錄因子復合物激活蛋白1（transcription factor complexes including activator protein-1,AP-1）通路。這些通路的激活可能促進炎癥反應，增加感染，甚至與癌癥發生相關[11]。

圖 5 暴露10 μg/mL、50 μg/mL或100 μg/mL自然產出的二氧化硅（宣威組）、工業生產的50 nm二氧化硅和結晶型二氧化硅48 h后BEAS-2B細胞成活率變化情況，數值采用均數±標準差表示。* 表示細胞成活率下降組間比較有差異，**表示組間比較有明顯差異。Fig 5 Changes in viability of BEAS-2B cells after 48 h exposure to 10 μg/mL, 50 μg/mL, or 100 μg/mL of naturally-occurring silica nanoparticles(Xuan Wei group), 50 nm industrially-produced silica particles and crystalline silica (Min-U-Sil5). Values are the Mean±SD from three independent experiments. *Indicates the decrease in cell viability was significantly different (P＜0.05), ** (P＜0.01).

圖 6 自然產出的納米二氧化硅、結晶型二氧化硅和工業生產的納米二氧化硅（50 nm）刺激24 h-72 h后，BEAS-2B細胞LDH水平變化情況，數值采用Mean±SD表示，*代表相同時間點上LDH水平上升組間比較有差異（P＜0.05），**代表LDH水平上升組間比較有明顯差異（P＜0.01）。Fig 6 The LDH level changes of BEAS-2B cells after 24 h-72 h exposure to naturally occurring silica nanoparticles (Xuan Wei group), 50 nm silica nanoparticles (industrial produced) and crystalline silica, values are Mean±SD from three independent experiments. *Indicated the LDH level differentb (P＜0.05), ** (P＜0.01).

圖 7 自然產出的納米二氧化硅、結晶型二氧化硅和工業生產的納米二氧化硅（50 nm）刺激24 h-72 h后，BEAS-2B細胞DCF熒光強度的變化。數值采用Mean±SD表示，*代表DCF熒光強度增加組間比較有差異（P＜0.05），**代表DCF熒光強度增加組間比較有明顯差異（P＜0.01）。Fig 7 The DCF-fluorescence increase of BEAS-2B cells after 24 h-72 h exposed to naturally occurring silica nanoparticles (Xuan Wei group), 50 nm silica nanoparticles (industrially produced) and crystalline silica. Values are Mean±SD from three independent experiments, *indicated the DCF-fluorescence increase differently (P＜0.05), ** (P＜0.01).

3 討論

中國云南省宣威地區是我國非吸煙女性肺癌發病率最高的地區之一。研究表明，宣威地區肺癌高發與吸煙和工業污染等因素相關不明顯，可能與當地開采和使用的C1煙煤中不同尋常的二氧化硅含量相關 。這種假設主要是通過初步的煤地質化學評價，發現C1煙煤中相對富集的硅元素提出，但沒有在統計學上定量，也沒有觀察二氧化硅顆粒物形態，然而，二氧化硅顆粒物形態在肺損傷方面是一個主要因素[12]。本研究的目的在于：①應用物理方法從宣威肺癌高發地區開采和使用的C1煙煤燃燒產物中分離出納米二氧化硅，觀察二氧化硅顆粒物的形態特征以及和其它元素之間的依存關系；②通過體外細胞實驗，明確這種自然產出的納米二氧化硅與工業生產的納米二氧化硅和結晶型二氧化硅對正常人支氣管上皮細胞的體外毒性有何不同。

3.1 C1煙煤燃燒底灰中的二氧化硅顆粒物分離與表征 我們應用物理方法從C1煙煤燃燒底灰中分離出的二氧化硅顆粒物，通過激光粒度分析后發現其粒經主要分布在30 nm到120 nm之間。顆粒物的粒徑是重要的物理參數，它決定了顆粒物在人體呼吸系統中的沉積位置，粗顆粒物（2.5 μm-10 μm）主要附著在上呼吸道內，細顆粒（0.1 μm-2.5 μm）大部分沉積在下呼吸道中，而納米顆粒物（＜0.1 μm）能深入末端支氣管中，為顆粒物進一步遷移及毒害作用創造了條件[13]。我們從C1煙煤底灰中分離出的二氧化硅顆粒物多數為納米級，這些顆粒物可以隨著清理灰槽和拋灑底灰過程中產生的飛灰進入呼吸道。我們在調查中發現，宣威地區農村女性主要承擔了清理灰槽和拋灑底灰作為農田肥料等工作，長時間吸入這些顆粒物可能對健康造成損害。另外，這種天然產出的納米二氧化硅顆粒物形態各異，多成球形，少數呈纖維狀，表面多不光滑，在相同質量濃度下，自然產出的納米二氧化硅顆粒物比工業生產的納米二氧化硅具有更大的表面積。能譜分析發現賦存有鋁、鈣和鐵等元素，目前沒有發現人類攝入鈣和鐵元素可能導致癌癥發生的報道，但是，如果人類過多的攝入鋁元素可能與癌癥發生相關[14]。因此，從煙煤底灰中分離出的納米二氧化硅顆粒物因其具有獨特的粒徑分布、巨大的比表面積和復雜的顯微組分可能造成比工業生產的納米二氧化硅和結晶型二氧化硅更嚴重的健康危害。

3.2 C1煙煤自然產出的納米二氧化硅對支氣管上皮細胞的體外毒性 物理方法從煤燃燒底灰中分離納米二氧化硅顆粒物較化學方法簡單、易行、廉價和分離過程無污染等特點，最重要的是這種方法沒有改變原有納米二氧化硅顆粒物的形貌、粒徑和顯微組份的依存關系。

通過使用從C1煙煤底灰中分離出的納米二氧化硅顆粒物刺激體外培養的ΒEAS-2Β細胞，發現對細胞成活率和細胞活性氧（ROS）水平的影響較明顯，當刺激時間超過24 h，與工業化生產的納米二氧化硅和結晶型二氧化硅相比均有差異，說明這種天然產出的納米二氧化硅顆粒物可能具有比結晶型二氧化硅和工業生產的納米二氧化硅更高的細胞毒性。 這種自然產出的納米二氧化硅顆粒物粒徑大小不等、表面不光滑、形態不規則，巨大的表面積可保持很高的生物學活性，能導致氧化應激甚至DNA損傷，這些影響被認為可能與癌癥發生相關[15]。另外，這種天然產出的納米二氧化硅還賦存有鋁、鈣和鐵等元素。因此，在進行C1煙煤中的納米二氧化硅顆粒物細胞毒性研究方面，既要考慮這些顆粒物的粒徑和形貌特征，還要考慮其顯微組分的依存關系。

對于致癌物質的分離和鑒定，是一個非常復雜的工作，本研究的主要成果是用物理方法分離出了煙煤燃燒產物中的納米二氧化硅顆粒物，保持了原有的理化特性，為進一步進行更深入的體外細胞實驗和標準動物模型的建立提供了物質基礎。