復(fù)方消斑靈對創(chuàng)傷性瘢痕作用的實驗研究

王毅兵 于海洲 熊存全 羅崇念 張德昌

1 鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇省鹽城市 224001； 2 鹽城市第一人民醫(yī)院燒傷整形科

復(fù)方消斑靈主要成分積雪草為傘形科積雪草屬植物積雪草Centella asiatica（Linn.）Urban的干燥全草。性味：苦、辛、寒。歸經(jīng)：歸肝、脾、腎經(jīng)。功能與主治：清熱解毒、利濕消腫。用于感冒高熱、濕熱黃疸、中暑腹瀉、砂淋血淋、癰腫瘡毒、跌打損傷。外用治刀傷出血、毒蛇咬傷；近有用于外治燒傷、皮膚潰瘍、手術(shù)傷口、肌腱粘連、瘢痕增生及硬皮病［1］。本研究以體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞、水浴燙傷動物模型為實驗對象，觀察自擬方復(fù)方消斑靈對成纖維細(xì)胞膠原蛋白的合成、對大鼠創(chuàng)面病理學(xué)以及免疫組織化學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及實驗動物 復(fù)方消斑靈（主要由積雪草、蜈蚣、五倍子、冰片等藥材組成）由本院自制；RPMI1640培養(yǎng)基系美國GIBCO公司生產(chǎn)；新生小牛血清由廣州蕊特生物科技有限公司提供；脯氨酸為西安雙德生物技術(shù)公司提供；Cy－clin B1、Cyclin C多抗（美國Santa Cruz公司）；PCNA多抗（丹麥Dako公司）；二抗為丹麥Dako公司En Vision系統(tǒng)；Waster大鼠由南通大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)［2］：手術(shù)中切下的增生性瘢痕組織在無菌條件下經(jīng)漂洗、剪碎，培養(yǎng)于含20%新生小牛血清的1640全培養(yǎng)液中，置37℃，5%CO2條件下原代培養(yǎng)，待細(xì)胞接近融合時經(jīng)胰酶消化傳代。

1.2.2 成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：將成纖維細(xì)胞接種于蓋玻片上，待細(xì)胞呈亞融合狀態(tài)后換至含0.3%小牛血清的RPMI1640中（避免培養(yǎng)液刺激細(xì)胞生長），48h后更換至含400mg／L復(fù)方消斑靈（p H值接近細(xì)胞培養(yǎng)液），20%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h，用無水乙醇固定，分別按常規(guī)處理標(biāo)本、Giemsa染色，在光鏡下觀察。電鏡觀察：接種、培養(yǎng)細(xì)胞和加入復(fù)方消斑靈（p H值接近細(xì)胞培養(yǎng)液）的方法同上，用戊二醛固定，經(jīng)丙酮脫水、包埋、切片、染色后在PHILIPSCM10透射電鏡下觀察。

1.2.33H－脯氨酸摻入法測成纖維細(xì)胞膠原蛋白的合成［3］：成纖維細(xì)胞104／孔，分種于24孔培養(yǎng)板上，靜置培養(yǎng)2d后，棄上清液，用無血清培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞2次，加入條件培養(yǎng)液200μL［含維生素C（50mg／m1）和3H－氨基丙腈（100mg／m1）］，3H－脯氨酸0.5mci／孔繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄上清液，用0.5%胰酶消化細(xì)胞，以多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上，液閃測定儀閃爍計數(shù)測定3H－脯氨酸摻入量。

1.2.4 創(chuàng)傷動物模型的建立［4］：成年 Wistar大鼠40只，雌性，平均體重200～250g／只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量3ml／kg，背部剃毛，采用自動恒溫恒壓水浴燙傷儀，在背部雙側(cè)燙取直徑2.5cm圓形創(chuàng)面各1個（1kg壓力、80℃、8s），單籠喂養(yǎng)，24h后切取創(chuàng)面皮膚組織，切片，蘇木素－伊紅（HE）染色。采用自身對照方法，分設(shè)復(fù)方消斑靈用藥組和對照組，復(fù)方消斑靈外涂于創(chuàng)面，3次／d，取傷后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、14d創(chuàng)面標(biāo)本（距創(chuàng)緣0.5cm），4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色：所有標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，4μm系列切片。采用二步法免疫組織化學(xué)染色，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2常溫孵育20min，蒸餾水洗3次，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）組置于0.01mol／L、p H 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中行抗原微波修復(fù)5min，磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1mol／L、p H 7.2）洗滌3次，加入1∶200稀釋的PCNA一抗，37℃ 孵育2h；Cyclin B1、Cyclin C組經(jīng)EDTA高壓抗原修復(fù)2min，PBS沖洗3次后分別加入1∶50稀釋的Cyclin B1一抗和1∶200稀釋的Cyclin C一抗37℃孵育4h，滴加生物素標(biāo)記的二抗常溫孵育45min，PBS漂洗3次，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察，Cyclin B1、Cyclin C及PCNA以細(xì)胞核染成棕黃色為陽性細(xì)胞，同時設(shè)不加一抗的非特異性對照。

1.2.6 組織學(xué)觀察：在400倍光鏡下觀察免疫組織化學(xué)結(jié)果，照相后每張切片隨機(jī)選取10個視野，記錄陽性細(xì)胞數(shù)并計算平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方消斑靈對成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成的影響 利用3H－脯氨酸摻入，在無血清培養(yǎng)的條件下，觀察復(fù)方消斑靈對成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成的影響，結(jié)果表明復(fù)方消斑靈對成纖維細(xì)胞的膠原合成有明顯抑制作用，濃度在5×10－4mol／L，3H－脯氨酸的摻入量比濃度為5×10－5mol／L時的摻入量明顯降低，兩組間相差非常顯著（P＜0.01）。在本實驗條件下，復(fù)方消斑靈濃度為5×10－3mol／L時，3H－脯氨酸摻入量減至最少，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方消斑靈對成纖維細(xì)胞膠原合成的影響

2.2 復(fù)方消斑靈對培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響 光電鏡觀察顯示，用藥組與對照組相比，成纖維細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)有明顯變化，表現(xiàn)為核分裂相較少，核仁變細(xì)小或缺失，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯變疏松，其中內(nèi)容物減少，核蛋白體有不同程度的脫顆粒現(xiàn)象，自噬性溶酶體增多，線粒體腫脹或空泡化。

2.3 大鼠創(chuàng)面大體觀察及病理學(xué)觀察 Wistar大鼠創(chuàng)面，經(jīng)復(fù)方消斑靈治療組在（8.00±1.12）d內(nèi)均完全愈合；非藥物對照組創(chuàng)面除1例因創(chuàng)面感染而14d愈合外，其余創(chuàng)面約在（10.00±1.36）d愈合。HE染色：傷后第3天復(fù)方消斑靈治療組開始有基底層細(xì)胞增生，第5天可見明顯增生的表皮細(xì)胞，胞體較大，排列緊密，由單層上皮細(xì)胞向復(fù)層上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以毛囊區(qū)附近增生活躍，其中有3只在第5天創(chuàng)面完全愈合。而非藥物對照組第3天開始有局部細(xì)胞增生，至第7天增殖明顯，細(xì)胞體積較小，分布疏松，以單層上皮細(xì)胞為主。

2.3 免疫組織化學(xué)觀察 Cyclin B1免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，復(fù)方消斑靈組在傷后第3天開始表達(dá)，主要位于基底細(xì)胞層，大部分表達(dá)于胞漿，小部分表達(dá)于胞核；第4天胞核表達(dá)明顯增多，胞漿淡染。第5天胞核顯著表達(dá)，與HE染色結(jié)果一致。對照組也在第3天開始有表達(dá)，但表達(dá)較弱，細(xì)胞數(shù)量少，并于第7天表達(dá)出現(xiàn)高峰，這與復(fù)方消斑靈組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 CyclinB1免疫組織化學(xué)結(jié)果

PCNA免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示與Cyclin B1表達(dá)結(jié)果一致，復(fù)方消斑靈組在傷后第3天基底層細(xì)胞和毛囊細(xì)胞均有表達(dá)，第5天表達(dá)顯著，而對照組PCNA表達(dá)較弱，與復(fù)方消斑靈組差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表3。Cyclin C免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，復(fù)方消斑靈治療組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。在傷后第2天基底細(xì)胞層就有部分細(xì)胞表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞核。第5天胞核表達(dá)明顯增多，胞漿淡染。

表3 PCNA免疫組織化學(xué)結(jié)果

表4 Cyclinc免疫組織化學(xué)結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)果表明，復(fù)方消斑靈具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合、刺激肉芽生長的作用。也能促進(jìn)成纖維細(xì)胞短時間內(nèi)變圓，脫壁、數(shù)量減少，直觀地說明，復(fù)方消斑靈同時具有抑制成纖維細(xì)胞的生長，干擾它正常的生理功能，進(jìn)而抑制瘢痕生長的雙相調(diào)節(jié)作用。本研究為進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)方消斑靈的臨床研究和開發(fā)，為新藥提供了依據(jù)。

［1］ 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草〔M〕.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2005：199－200.

［2］ 張卓然，主編 .培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)〔M〕.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2004.

［3］ 董麗龍，傅士龍，韓素萍 .人上皮性卵巢癌組織中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)〔J〕.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)報，2001，（7）.

［4］ 付小兵，孫同柱，盛志勇.幾種用于創(chuàng)傷修復(fù)研究的動物模型〔J〕.中華實驗外科雜志，1999，5：479－480.