瘦素預處理對小鼠心肌冷/熱缺血再灌注損傷的差異性

呂祥威 徐彤彤 武 琦 覃 泱 (桂林醫學院附屬醫院特需病區，廣西 桂林 541001)

心肌有瘦素及瘦素受體表達，表明心肌是瘦素直接作用的靶器官，瘦素有促進心肌再塑的作用，而瘦素處理能減輕心肌缺血再灌注損傷(IRI)程度，起到心肌保護作用〔1〕。心肌冷IRI是指心臟移植領域中的心臟冷保存以及移植后的供心熱灌注引起的損傷。心肌熱IRI是指阻斷的冠狀動脈再通后出現的心臟功能、代謝及結構上的損傷。由于心臟移植的冷IRI不可避免，并且心肌IRI是心臟器官移植損傷的主要因素，因此如何減輕移植心臟的心肌IRI成為了臨床心臟移植領域中的重要課題〔2，3〕。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性C57BL/6小鼠30只，8～10周齡，體重20～25 g。隨機分為3組:(1)心肌冷IRI組:瘦素預處理〔術前30 min予腹腔注射重組瘦素(美國R＆D Systems公司，劑量為50 μg/kg〕。后行同種間小鼠腹部心臟移植，供體置于4℃UW液中保存6小時。(2)心肌熱IRI組:本組小鼠于MIRI術前30 min予腹腔注射重組瘦素。(3)心肌IRI模型組。分別于術后6 h收獲移植心臟與血清標本。

1.2 小鼠腹部心臟移植模型的制作 (1)小鼠心臟移植模型制作:手術采用乙醚吸入麻醉，供體小鼠麻醉滿意后固定，迅速沿正中切口進入腹腔，顯露下腔靜脈，經下腔靜脈肝素化后，剪開腹主動脈放血并迅速剪開膈肌，沿兩側腋前線剪斷肋骨直至頸部，剪開心包，將胸腺組織向上推移，充分顯露心臟。充分游離主動脈和肺動脈，于頭臂干分支近側將主動脈橫斷;在肺動脈后方將肺靜脈連同心臟后的組織(包括下腔靜脈和上腔靜脈)一并結扎并切斷;然后將肺動脈在分叉處橫斷，取下供心，置于4℃ UW液中保存6 h。受體小鼠用上法麻醉滿意后固定。消毒后經正中切口進腹。腹壁切口兩側采用自制拉鉤牽拉固定。剪開小腸與直腸間的系膜，將小腸向左上腹推移，充分顯露下腔靜脈和腹主動脈。稍加游離后阻斷下腔靜脈及腹主動脈血流。于腹主動脈及下腔靜脈前壁作平行縱行小切口，分別行供心主動脈和受體腹主動脈端側吻合及肺動脈和下腔靜脈端側吻合。動脈吻合方法為:將供心置于小鼠右側腹腔，于吻合口兩端各作一牽引線，自尾側一針連續縫合至頭側打結固定后，翻轉心臟至左側，行后壁連續縫合，與尾側牽引線打結固定。靜脈吻合方法為一針連續縫合后壁先縫法，吻合至對側時自身打結固定一次。吻合完畢后，先開放遠端血流，后松開近端阻斷帶。將腸管復位后，分兩層連續縫合關閉腹腔。(2)小鼠缺血/再灌注(MIRI)模型制作:結扎小鼠冠狀動脈左前降支，人為造成小鼠急性心肌缺血。小鼠吸入乙醚麻醉，切開頸部正中皮膚，鈍性分離肌肉至氣管。PE-90經口氣管插管接小鼠人工呼吸機。頸部各組織逐層縫合。小鼠冠脈左前降支開胸結扎:在胸骨左側1.5～2.0 mm處切開皮膚，皮下組織鈍性分離，暴露肋骨，鈍性分離第4肋間隙肋間肌。使用拉鉤拉開胸壁，暴露心臟，小心剪開心包膜，輕壓住心臟。進針(8-0絲線)在左心耳下緣1～2 mm處，深度約1 mm，出針方向斜向右上方肺動脈圓錐出，針距約2 mm，留線經PE-10管結扎左前降支近端。缺血30 min后松開線結，紀錄再灌注時間。

1.4 移植心臟組織形態學分析 分別于手術后6 h收獲心臟標本。供心組織行常規HE染色，按文獻報道的標準，本試驗組標本的組織病理學損傷半定量及中性粒細胞計數由同一病理科醫生行雙盲評定。

1.5 血清及心肌瘦素測定 心臟取血0.5 ml，搖勻，抗凝，4℃，1 000 r/min低溫離心8 min，分離血清置于－70℃冰箱保存待測。左室心底部取心肌，生理鹽水0.5 ml加入50 mg心肌中，低溫勻漿液中加抑肽酶，煮沸10 min，3 000 r/min離心，將上清液保存于－20℃冰箱中待測。

1.6 血清炎性細胞因子白介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平及心肌髓過氧化物酶(MPO)活性測定 血清IL-6，IL-1β，TNF-α水平采用 ELISA法檢測，心肌中性粒細胞活性行MPO活性檢測，操作按試劑盒說明。血清心肌肌鈣蛋白I(TnI)利用美國Beckman Coulter公司的Access臨床生化分析系統，采用化學發光法進行定量測定，試劑盒由南京強欣生物技術有限公司生產。

1.8 統計學處理 采用統計軟件SPSS13.0進行統計學分析，數據表示為，兩組均數比較應用獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用方差分析。

2 結果

2.1 瘦素預處理顯著性改善移植小鼠移植心臟心肌損傷MIRI組心肌組織結構紊亂，片狀局灶性出血壞死，并有大量中性粒細胞聚集;而瘦素預處理組上述病變明顯改善，結構紊亂，雖然有壞出血死，但是中性粒細胞聚集明顯減少(見圖1)。瘦素預處理明顯降低心臟移植組和MIRI組6 h血清心肌TnI的水平〔(42.8±2.1)vs(43.2±1.5)、(79.1±1.3)ng/ml〕;但是心臟移植組和瘦素預處理組無統計學意義(P＞0.05)。

圖1 各組6 h后小鼠移植心臟病理學改變(HE，×400)

2.2 瘦素預處理可以明顯減輕心肌冷/熱IRI的炎性細胞因子水平 與MIRI組比較，心臟移植組和瘦素預處理組6 h血清炎性細胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6表達明顯降低，心肌 MPO水平同樣降低顯著(P均＜0.01)。但是，心臟移植組和瘦素預處理組之間變化無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組炎性細胞因子TNF-α，IL-1 β，IL-6及心肌MPO水平檢測結果(n=10，)

表1 各組炎性細胞因子TNF-α，IL-1 β，IL-6及心肌MPO水平檢測結果(n=10，)

與MIRI組比較:1)P＜0.01

組別TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)MPO(ng/mg)76.1±1.2 27.8±3.1 621.1±113.2 35.1±6.3心臟移植組 35.3±5.91)14.2±2.21)335.1±36.11)17.5±4.31)瘦素預處理組 31.2±6.21)15.2±3.11)315.2±34.91)16.7±3.91)MIRI組

3 討論

我們的前期研究顯示:高瘦素水平實際上參與了大鼠AMI心肌損傷過程及臨床心肌梗死病人的損傷機制〔4，5〕。盡管冷/熱IRI的機制可能不完全相同，但是本研究結果提示:瘦素預處理對心肌冷/熱IRI均有明顯的保護作用。心肌冷/熱IRI是一個復雜的病理生理變化過程，中性粒細胞在MIRI中起關鍵性的損傷作用，過度的炎性反應無疑是參與損傷的重要環節〔6，7〕。本研究提示瘦素預處理對小鼠心肌冷/熱IRI之間的保護作用沒有統計學差異。

1 Purdham DM，Zou MX，Rajapurohitam V，et al.Rat heart is a site of leptin production and action〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004;287(6):H2877-84.

2 Jahania MS，Sanchez JA，Narayan P，et al.Heart preservation for transplantation:principles and strategies〔J〕.Ann Thorac Surg，1999;68(5):1983-7.

3 Zheng X，Lian D，Wong A，et al.Novel small interfering RNA-containing solution protecting donor organs in heart transplantation〔J〕.Circulation，2009;120(12):1099-107.

4 徐彤彤，陽躍忠.急性心肌梗死患者血清瘦素水平的變化及其臨床意義〔J〕.臨床內科雜志，2007;24(2):106-8.

5 徐彤彤，戴 玲.瘦素與急性心肌梗死溶栓后ST段變化的關系探討〔J〕.廣西醫科大學學報，2007;24(3):403-5.

6 Jordan JE，Zhao ZQ，Vinten-Johansen J.The role of neutrophils in myocardial ischemia-reperfusion injury〔J〕.Cardiovasc Res，1999;43(4)860-78.

7 姚艷敏，徐彤彤，武 琦，等.瘦素對兔急性肺栓塞后TNF-α、IL-1β、Hs-CRP水平的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(20):3977-8.