延胡索乙素抗大鼠血栓作用研究

楊 娟 ，張莉蓉

1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450001；2鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450001

延胡索具有活血、行氣、止痛的作用，主治氣滯血瘀等證[1]。延胡索乙素是從罌粟科植物延胡索中提取的20余種活性生物堿之一[2]。隨著研究的不斷深入，對(duì)該藥的藥理作用也不斷有新的認(rèn)識(shí)。由于其良好的鎮(zhèn)痛[3]、抗腦缺血[4]、抗心律失常[5]、抗心肌缺血[6]等作用，長期以來一直廣泛應(yīng)用于臨床。本文重點(diǎn)研究延胡索乙素的抗血栓作用。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

阿司匹林泡騰片（阿斯利康制藥有限公司，批號(hào):1004017）；延胡索乙素（江蘇省南京市藥材公司，純度＞95%）；注射用生理鹽水（鄭州永和藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào):090528）；烏拉坦（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):080411）；枸櫞酸鈉（北京化工廠，批號(hào):070821）；凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血酶時(shí)間（APTT）測定試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所，批號(hào):111208）。

1.2 儀器

DS-671分析天平（日本寺岡）；TG 16-WS高速離心機(jī)（南賽特儀器有限公司）。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雌雄各半，體重200～250 g，購自鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK（豫）2005-0001。

2 方 法

2.1 大鼠結(jié)扎下腔靜脈致成血栓模型

SD大鼠隨機(jī)分為5組空白對(duì)照組、延胡索乙素低、中、高劑量組（20、40、80 mg·kg-1）、阿司匹林組（40 mg·kg-1），每組 8 只。各組動(dòng)物每天灌胃一次，連續(xù)7 d，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水，各組動(dòng)物末次灌胃給藥后2 h，腹腔注射20%烏拉坦（5 mL·kg-1）麻醉，打開腹腔在左腎下方手術(shù)結(jié)扎大鼠下腔靜脈，縫合腹壁，造成大鼠下腔靜脈血栓模型，4 h后重新打開腹腔，在結(jié)扎下方2 cm處用止血鉗夾住血管，將該段血管內(nèi)血液吸盡，然后縱行剪開管腔，觀察有無血栓形成，如有即取出血栓，用濾紙沾去血栓表面的浮血，置60℃烤箱烤20 h，冷卻后稱血栓干重[7]。

藥物對(duì)血栓抑制率（%）=（空白組血栓重量-給藥組血栓重量）/空白組血栓重量×100%。

2.2 動(dòng)靜脈旁路血栓模型

各組給藥同前，大鼠用烏拉坦麻醉，頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈及左頸外靜脈，在三段聚乙烯管的中段放入一根長8 cm的絲線，將肝素生理鹽水溶液（5 U·mL-1）充滿聚乙烯管，將其一端插入右側(cè)頸總動(dòng)脈，另一端插入左頸外靜脈，打開動(dòng)脈夾，血液從右頸總動(dòng)脈經(jīng)聚乙烯管返回左頸外靜脈。開放血流20 min后，中斷血流，迅速取出絲線稱重，總重量減去絲線重量，即為血栓濕重[8]。然后放入烤箱于60℃烤20 h，冷卻后立即稱重，即為血栓干重。

2.3 FeCl3誘導(dǎo)大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型[9-10]

大鼠20%烏拉坦5 mL·kg-1腹腔注射麻醉后，沿頸正中線切開，鈍性分離右側(cè)頸動(dòng)脈1 cm長，放入0.6 cm寬的封口膠條，再用浸有20%FeCl3溶液的濾紙條（1.0 cm×0.5 cm）環(huán)裹分離備用的頸動(dòng)脈段，并用封口膠條封住，15 min后，取下濾紙條。40 min后，結(jié)扎濾紙條兩端血管，精確剪下濾紙條包裹的血管段，用潔凈濾紙吸干血管內(nèi)余血，取出血栓后放入烤箱60℃烤20 h，冷卻后立即稱重，即為血栓干重。

2.4 PT、APTT 測定

各組大鼠給藥后2 h取靜脈血，全血按9∶1加入3.8%抗凝劑枸櫞酸鈉，混勻，3000r·min-1離心 10min，得貧血小板血漿（PPP）。樣品于37℃預(yù)溫區(qū)預(yù)溫1 min，加入PT或APTT試劑混勻，37℃預(yù)溫1 min，按試劑盒說明書及儀器使用要求測定APTT、PT。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié) 果

3.1 延胡索乙素對(duì)大鼠下腔靜脈結(jié)扎血栓形成的影響

與空白組相比，延胡索乙素各劑量組均可抑制大鼠靜脈結(jié)扎血栓的形成，且抑制效果呈劑量依賴性。延胡索乙素低劑量組較空白組血栓重量雖有下降，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中、高劑量組較空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 延胡索乙素對(duì)大鼠下腔靜脈結(jié)扎致血栓形成影響（±s，n=8）

表1 延胡索乙素對(duì)大鼠下腔靜脈結(jié)扎致血栓形成影響（±s，n=8）

注:與空白組相比 *P＜0.05，**P＜0.01

延胡索乙素802.7±0.5**54.2

3.2 延胡索乙素對(duì)大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓形成的影響

與空白組相比，延胡索乙素可抑制大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓的形成，延胡索乙素低劑量組較空白組血栓重量雖有下降，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中、高劑量組較空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 延胡索乙素對(duì)大鼠動(dòng)靜脈旁路致血栓形成影響（±s，n=8）

表2 延胡索乙素對(duì)大鼠動(dòng)靜脈旁路致血栓形成影響（±s，n=8）

注:與空白組相比 *P＜0.05，**P＜0.01

延胡索乙素組802.7±0.6**43.7

3.3 延胡索乙素對(duì)FeCl3致大鼠頸動(dòng)脈血栓形成的影響

造模實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)eCl3使動(dòng)脈產(chǎn)生血栓，而延胡索乙素各劑量組對(duì)動(dòng)脈血栓能有效地產(chǎn)生抑制作用；低劑量組減少血栓形成但與對(duì)照組沒有顯著性差異，中、高劑量組則有效地減輕血栓重量，且與空白組相比有顯著性差異。結(jié)果見表3。

表3 延胡索乙素對(duì)FeCl3致大鼠頸動(dòng)脈血栓形成的影響（±s，n=8）

表3 延胡索乙素對(duì)FeCl3致大鼠頸動(dòng)脈血栓形成的影響（±s，n=8）

注:與空白組相比 *P＜0.05，**P＜0.01

3.4 延胡索乙素對(duì)PT、APTT的影響

與空白對(duì)照組比較，延胡索乙素各劑量組均能使大鼠血漿的PT、APTT明顯延長，且中、高劑量組與空白組相比有顯著性差異。結(jié)果見表4。

表4 延胡索乙素對(duì)大鼠PT、APTT的影響（±s，n=8）

表4 延胡索乙素對(duì)大鼠PT、APTT的影響（±s，n=8）

注:與空白組相比 *P＜0.05，**P＜0.01

4 討 論

雖然近年來介入式醫(yī)藥療法對(duì)預(yù)防和治療大范圍的血栓事件取得了一些進(jìn)展，但其發(fā)病率和死亡率依然很高。因此仍亟需更安全、更有效的抗血栓治療藥物。靜脈血栓性和動(dòng)脈血栓性疾病常被認(rèn)為是不同發(fā)病機(jī)制和不同臨床特征的疾病，但靜脈血栓性疾病與動(dòng)脈血栓性疾病有許多共同的致病因子[11]；而且兩者在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中互相促進(jìn)[12-13]。基于這一事實(shí)，本實(shí)驗(yàn)從靜脈血栓、動(dòng)脈血栓及動(dòng)靜脈旁路血栓綜合檢驗(yàn)延胡索乙素的抗血栓活性。

FeCl3血栓模型就是通過刺激內(nèi)皮損傷激活凝血通路造成血栓[14]；誘導(dǎo)的動(dòng)脈血栓主要由血小板和纖維蛋白組成[15]，模擬臨床動(dòng)脈血栓疾病；而下腔靜脈結(jié)扎模型和動(dòng)靜脈旁路模型分別模擬臨床上靜脈血栓和混合血栓疾病。實(shí)驗(yàn)表明，延胡索乙素對(duì)大鼠靜脈血栓、動(dòng)脈血栓及動(dòng)靜脈旁路血栓模型均有較好作用，并能有效延長PT和APTT指標(biāo)，且對(duì)PT的延長更為顯著，提示延胡索乙素可能主要是通過抑制凝血外源性途徑來抑制血栓的形成。更深入的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]呂清文，叢雅琴.延胡索藥理作用及臨床應(yīng)用淺議[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2005，26（1）:26.

[2]丁兆夢.中藥藥效學(xué)與臨床[M].北京:中國中醫(yī)藥科技出版社，1999:167-9.

[3]Hu JY,Jin GZ.Effect of tetrahydropalmatine analogues on Fos expression induced by formalin-pain [J].Acta Pharmacol Sin,1999,20(3)∶193-200.

[4]梁 健，王富強(qiáng)，鄭平香，等.延胡索乙素抗脂質(zhì)過氧化作用與對(duì)腦缺血再灌注大鼠行為及病理改變的保護(hù)[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，1999，15（2）:167-9.

[5]Huang K,Dai GZ,Li XH,et al.Blocking L-calcium current by l-tetrahydropalmatine in single ventricular myocyte of guinea pigs[J].Acta Pharmacol Sin,1999,20(10)∶907-11.

[6]汪永孝，鄭云敏，譚月華.四氫巴馬汀抗缺血再灌注心律失常的作用及其機(jī)理 [J].中國藥理學(xué)通報(bào)，1993，9（5）:358-61.

[7]包玉龍，杜佳林，李顯華，等.丹龍膠囊抗血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2010，27（3）:19-21.

[8]陳云華，張碩峰，孫建寧，等.血塞通滴丸抗大鼠血栓形成及溶栓作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中國中藥雜志，2007，32（3）:253-6.

[9]夏紅梅，高云華，卞愛娜，等.動(dòng)脈血栓模型建立的方法學(xué)研究[J]. 中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2007，23（1）:13-6.

[10]Wang X,Xu L.An optimized murlne model of ferricchloride induced arterial thrombosis for thrombosis research[J].Thromb Res,2005,115(1-2)∶95-100.

[11]Walker ID,Greaves M,Preston FE.Investigation and management of heritable thrombophilia[J].Br J Haematol,2001,114(3)∶512-28.

[12]Prandoni P,Bilora F,Marchiori A,et al.An association between atheroslerosis and venous thrombosis[J].N Engl J Med,2003,348(10)∶1435-41.

[13]Eliasson A,Bergqvist D,Bjorck M,et al.Incidence and risk of venous thromboembolism in patients with verified arterial thrombosis∶a population study based on 23,796 consecutive autopsies[J].J Thromb Haemost,2006,4(9)∶1897-902.

[14]郭朝鋒.三氯化鐵動(dòng)物血栓模型方法學(xué)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中華實(shí)用診斷與治療雜志，2010，24（6）:537-9.

[15]Wong PC,Crain EJ,Xin B,et al.Apixaban,an oral,direct and highly selective factor Xa inhibitor∶in vitro,antithrombotic and antihemostatic studies [J].J Thromb Haemost,2008,6(5)∶820-9.