南海軟海綿Halichondria sp.化學(xué)成分研究

胡 靜，楊 斌，孫見凡，雷 輝，劉永宏*

1中國科學(xué)院南海海洋研究所中科院海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海洋微生物中心，廣州 510301;2中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

南海軟海綿Halichondria sp.化學(xué)成分研究

胡 靜1，2，楊 斌1，孫見凡1，雷 輝1，劉永宏1*

1中國科學(xué)院南海海洋研究所中科院海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海洋微生物中心，廣州 510301;2中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

為了尋找有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，對從采集自中國南海的軟海綿(Halichondriasp.)進(jìn)行了化學(xué)成分研究，從中共分離得到了9個化合物，并對部分化合物進(jìn)行了抗菌活性測試。根據(jù)現(xiàn)代波譜技術(shù)并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，鑒定化合物的結(jié)構(gòu)為:1，2，3，4-四氫-3-羧基-2-卡波林(1)，色氨酸(2)，環(huán)(異亮氨酸-脯氨酸)(3)，開環(huán)(脯氨酸-纈氨酸)(4)，環(huán)(丙氨酸-脯氨酸)(5)，膽甾醇(6)，二-(2-乙基己基)鄰苯二甲酸酯(7)，鄰苯二甲酸正丁異丁酯(8)和鄰苯二甲酸二異丁酯(9)。

軟海綿;化學(xué)成分;抗菌

海綿是最原始、最簡單的多細(xì)胞動物，廣泛分布于自赤道到兩極不同深度的海域。自二十世紀(jì)五十年代以來，從海綿體內(nèi)分離得到的活性次生代謝產(chǎn)物一直是海洋天然藥物的重要來源［1-3］。Halichondria屬軟海綿屬于尋常海綿綱、軟海綿目、軟海綿科動物。由于顏色、形狀多變，其分類鑒定有一定難度。該屬軟海綿中含有結(jié)構(gòu)類型豐富的次生代謝產(chǎn)物，如大環(huán)內(nèi)酯、萜類、鞘類脂糖苷、甾醇、生物堿、內(nèi)酰胺等，其中很多化合物都具有顯著的抗菌、抗腫瘤、抗病毒等生物活性［4］。

我國南海地處熱帶亞熱帶，海域遼闊，海洋資源極為豐富，是世界上海綿集中分布的海域之一。為了尋找有重要生物活性和藥用前景的海洋天然產(chǎn)物，開發(fā)我國的海洋生物資源，我們對采集自海南三亞海域的軟海綿Halichondria sp.進(jìn)行了化學(xué)成分研究。通過一系列硅膠、凝膠柱層析以及高效液相等分離手段，從該生物中分離得到了9個化合物，經(jīng)現(xiàn)代波譜技術(shù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)對照，確定其結(jié)構(gòu)分別為:1，2，3，4-四氫-3-羧基-2-卡波林(1)，色氨酸(2)，環(huán)(異亮氨酸-脯氨酸)(3)，開環(huán)(脯氨酸-纈氨酸) (4)，環(huán)(丙氨酸-脯氨酸)(5)，膽甾醇(6)，二-(2-乙基己基)鄰苯二甲酸酯(7)，鄰苯二甲酸正丁異丁酯(8)和鄰苯二甲酸二異丁酯(9)。這些化合物均是首次從該屬海綿中分離得到。本文運(yùn)用圓形紙片法對化合物1～6在濃度為100 μg/紙片的條件下進(jìn)行了抗菌活性測試，結(jié)果顯示化合物1～6對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌這三種菌株均不表現(xiàn)抑制作用。

圖1 化合物1～9的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of compounds 1-9

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料

Agilent 1200 LC-MS質(zhì)譜儀;Bruker AC 500核磁共振儀;Hitachi L-2400高效液相;YMC ODS-H80 (250×10 mm i.d.，4 μm)半制備柱;Sephadex LH-20;柱層析硅膠由青島海洋化工分廠生產(chǎn);各種溶劑均為分析純。

軟海綿Halichondriasp.于2008年7月采集自我國南海海域，樣品由韓國國立生物資源研究院無脊椎動物研究室的Kyung Jin Lee博士鑒定，標(biāo)本保藏于廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，編號為0807005。

1.2 提取與分離

將采集的新鮮的海綿樣品(濕重4 kg)切成碎片后用95%的工業(yè)酒精浸泡提取3次，提取液減壓濃縮，提取部位用2 L水溶解，先用2 L氯仿萃取3次，得到氯仿部位80 g，水相在用2 L正丁醇萃取3次，得到正丁醇部位52 g。氯仿部位采用正相硅膠柱分離，以氯仿:甲醇(100∶1，50∶1，25∶1，9∶1，6∶1，3∶1)梯度洗脫，經(jīng)薄層板檢測后合并相似流份得到15個組分(F1～F15)。F5采用正相硅膠柱分離，以氯仿:甲醇(100∶1，50∶1，25∶1，9∶1)梯度洗脫得到7個組分(F5-1～F5-7)。F5-4采用正相硅膠柱分離，以石油醚:丙酮(6∶1，3∶1，2∶1)梯度洗脫得到化合物9(8.9 mg);F5-7采用正相硅膠柱分離，以石油醚:乙酸乙酯(3∶1)洗脫得到化合物6(3.6 mg)和7 (7.4 mg)。F6先經(jīng)葡聚糖凝膠柱脫色素，后采用正相硅膠柱分離，以石油醚:乙酸乙酯(3∶1)洗脫得到化合物8(9.7 mg)。F13先經(jīng)葡聚糖凝膠柱脫色素，后采用薄層制備板制備，以石油醚:乙酸乙酯(1∶2)展開得到化合物5(5.4 mg)。正丁醇部位采用正相硅膠柱分離，以氯仿:甲醇(20∶1，9∶1，6∶1，3∶1，2∶1，1∶1)梯度洗脫，經(jīng)薄層板檢測后合并相似流份得到12個組分(f1～f12)，f9先經(jīng)葡聚糖凝膠脫色素，后采用高效液相色譜(YMC-Pack ODS柱，250× 10 mmI.D.，2 mL/min)分析制備，以甲醇:水(20∶80)為流動相分離得到化合物1(3.4 mg)、2(5.1 mg)、3 (4.3 mg)和4(3.3 mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

1，2，3，4-四氫-3-羧基-2-卡波林(1) 白色固體;ESI-MS m/z:217［M+H］+。1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.49(1H，d，J=7.8 Hz，H-6)，7.33 (1H，d，J=8.0 Hz，H-9)，7.12(1H，t，J=7.2 Hz，H-8)，7.04(1H，t，J=7.4 Hz，H-7)，4.37(2H，s，H-13)，3.90(1H，m，H-2)，3.33(1H，m，H-3a)，3.00 (1H，t，H-3b);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:40.8 (t，C-13)，59.1(d，C-2)，173.8(s，C-1)，24.5(t，C-3)，106.4(s，C-4)，126.9(s，C-5)，118.9(d，C-6)，120.3(d，C-7)，123.0(d，C-8)，112.2(d，C-9)，138.5(s，C-10)，129.8(s，C-12)。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5，6］基本一致，故該化合物鑒定為1，2，3，4-四氫-3-羧基-2-卡波林。

色氨酸(2) 白色固體;ESI-MS m/z:205［M+ H］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.71(1H，d，J =8.0 Hz，H-4)，7.37(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，7.20 (1H，s，H-2)，7.13(1H，t，J=7.5 Hz，H-5)，7.06 (1H，t，J=7.5 Hz，H-6)，3.86(1H，m，H-2')，3.53 (1H，m，H-1a')，3.16(1H，m，H-1b')。根據(jù)以上核磁共振圖譜數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)［5，7］對比，鑒定該化合物為色氨酸。

環(huán)(異亮氨酸-脯氨酸)(3) 白色粉末;ESI-MS m/z:211［M+H］+;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ: 4.22(1H，m，H-6)，4.09(1H，m，H-9)，3.60(1H，m，H-3a)，3.52(1H，m，H-3b)，2.33(1H，m，H-5a)，2.18(1H，m，H-4a)，2.05(2H，m，H-5b，10)，1.92 (1H，m，H-4b)，1.45(1H，m，H-11a)，1.34(1H，m，H-11b)，1.08(3H，d，H-12)，0.96(3H，d，H-13);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:165.0(s，C-1)，47.0(t，C-3)，23.4(t，C-4)，29.5(t，C-5)，54.8(d，C-6)，169.0(s，C-7)，59.8(d，C-9)，37.1(d，C-10)，25.4 (t，C-11)，12.5(q，C-12)，16.0(q，C-13)。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］基本一致，故該化合物鑒定為環(huán)(異亮氨酸-脯氨酸)。

開環(huán)(纈氨酸-脯氨酸)(4) 白色粉末;ESIMS m/z:212［M-H］-;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ: 4.22(1H，t，J=7.0 Hz，H-6)，4.06(1H，bs，H-9)，3.57(1H，m，H-3a)，3.52(1H，m，H-3b)，2.50(1H，m，H-5a)，2.34(1H，m，H-4a)，2.04(1H，m，H-5b)，1.96(2H，m，H-4b，H-10)，1.11(3H，d，J=7.3Hz，H-12)，0.95(3H，d，J=6.9Hz，H-11)。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］基本一致，故該化合物鑒定為開環(huán)(纈氨酸-脯氨酸)。

環(huán)(丙氨酸-脯氨酸)(5) 白色粉末;EI-MS m/ z:167［M-H］-;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.86 (1H，s，NH-8)，4.10(2H，m，H-6，H-9)，3.58(1H，m，H-3a)，3.52(1H，m，H-3b)，2.32(1H，m，H-4a)，2.09(1H，m，H-5a)，1.88(1H，m，H-4b)，1.66(1H，m，H-5b)，1.45(3H，d，J=6.5 Hz，H-10)。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，核磁共振圖譜與文獻(xiàn)［8］基本一致，故該化合物鑒定為環(huán)(丙氨酸-脯氨酸)。

膽甾醇(6) 白色絮狀晶體;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.35(1H，m，H-6)，3.50(1H，m，H-3)，1.01(3H，s，H-19)，0.92(3H，m，H-21)，0.85(3H，m，H-26)，0.82(3H，m，H-27)，0.68(3H，s，H-18)。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，核磁共振圖譜與文獻(xiàn)［10］基本一致，同時與標(biāo)準(zhǔn)品TLC對照，鑒定該化合物為膽甾醇。

二-(2-乙基己基)鄰苯二甲酸酯(7) 無色油狀物;ESI-MS m/z:391［M+H］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.71(2H，m，H-3，6)，7.53(2H，m，H-3，5)，4.22(4H，m，H-1'，1')，1.69(2H，m，H-2'，2')，1.43 (4H，m，H-7'，7')，1.34(12H，m)，0.91(12H，m，H-6'，6'，8'，8');13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:168.8 (s，C-7，C-8)，132.5(s，C-1，2)，130.9(d，C-4，5)， 128.8(d，C-3，6)，68.2(t，C-1'，1')，38.8(d，C-2'，2')，30.4(t，C-3'，3')，29.7(t，C-4'，4')，23.0(t，C-5'，5')，14.1(q，C-6'，6')，23.8(t，C-7'，7')，11.0 (q，C-8'，8')。經(jīng)與文獻(xiàn)對照［8］，鑒定化合物為二-(2-乙基己基)鄰苯二甲酸酯。

鄰苯二甲酸正丁異丁酯 (8) 無色油狀物; ESI-MS m/z:279［M+H］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.71(2H，m，H-3，6)，7.51(2H，m，H-4，5)，4.30(2H，t，J=7.0 Hz，H-1')，4.08(2H，d，J=7.0 Hz，H-1')，2.03(1H，m，H-2')，1.71(2H，m，H-2')，1.44(2H，m，H-3')，0.97(6H，m，H-3'，4')，0.93 (3H，t，J=7.5 Hz，H-4')。經(jīng)與文獻(xiàn)［11］對照，該化合物被鑒定為鄰苯二甲酸正丁異丁酯。

鄰苯二甲酸二異丁酯 (9) 無色油狀物;ESIMS m/z:279［M+H］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz) δ:7.73(2H，m，H-3，6)，7.63(2H，m，H-4，5)，4.07 (4H，d，J=6.5 Hz，H-1'，1')，2.02(2H，m，H-2'，2' )，0.99(12H，d，J=7 Hz，H-3'，3'，4'，4')。化合物9與化合物8很相近，同時與文獻(xiàn)［5］數(shù)據(jù)比較推斷化合物為鄰苯二甲酸二異丁酯。

2.2 討論

化合物1，2屬于氨基酸及其衍生物類型。化合物3～5屬于二酮哌嗪類型，此類化合物最早從中草藥中分離得到，后在海洋微生物的化學(xué)成分研究中非常常見。此外，其他海洋生物如海綿、海星和紅藻等也有研究報道。有學(xué)者推斷其他海洋生物中分離得到的二酮哌嗪類化合物可能來自于與其共生附生微生物，而非這些生物本身代謝產(chǎn)生，但目前缺乏足夠的證據(jù)。許多二酮哌嗪類化合物顯示了很好的細(xì)胞毒、抗菌、抗污損以及植物生長調(diào)節(jié)等生物活性［12］。化合物7～9是一種工業(yè)增塑劑，并非海綿自身的代謝產(chǎn)物，其來源可能是由于人類的活動而進(jìn)入海洋，最后富集在海綿體內(nèi)。

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Chemical Constituents of Marine Sponge Halichondria sp.from the South China Sea

HU Jing1，2，YANG Bin1，SUN Jian-fan1，LEI Hui1，LIU Yong-hong1*

1Key Laboratory of Marine Bio-resources Sustainable Utilization，Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica，Research Center for Marine Microbes，South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301，China;2Graduate school of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China

Nine known compounds were isolated from the South China Sea spongeHalichondriasp.and the antibacterial activities of compounds 1-6 were tested.Their structures were identified as 1，2，3，4-tetrahydro-3-carboxy-2-carboline (1)，tryptophan(2)，cyclo-(Ile-Pro)(3)，seco-((S)-Pro-Val)(4)，cyclo-(Ala-Pro)(5)，cholesterol(6)，bis(2-ethylhexyl)phthalate(7)，phthalie acid butyl isobutyl ester(8)，and 1，2-benzenedicarboxylic acid diisobutyl ester(9) on the basis of detailed spectroscopic analysis and comparison with the data reported in the literature.

Halichondriasp.;chemical constituents;antibacterial activity

Q939.11+2;R931.77

A

1001-6880(2012)05-0614-04

2010-11-04 接受日期:2011-04-29

國家自然科學(xué)基金項目(30973679)

*通訊作者 Tel:86-20-89023244，E-mail:yonghongliu@scsio.ac.cn