白術多糖WAM-1結構的色譜分析和原子力顯微鏡觀察

伍樂芹，姜紹芬，張 靜

陜西師范大學食品工程與營養科學學院，西安 710062

白術多糖WAM-1結構的色譜分析和原子力顯微鏡觀察

伍樂芹，姜紹芬，張 靜*

陜西師范大學食品工程與營養科學學院，西安 710062

通過熱水浸提法從草本植物白術根莖提取的水溶性粗多糖，經DEAE-52纖維素柱層析分離和Sephadex G-200凝膠過濾柱層析純化，得到組分WAM-1。采用高效液相色譜(HPLC)檢測WAM-1的純度，氣相色譜(GC)對其單糖組分進行分析，原子力顯微鏡(AFM)對其分子外貌進行觀測。結果顯示:WAM-1為均一多糖，由葡萄糖和半乳糖以3.01∶1摩爾比構成;在不同濃度溶液條件下，WAM-1分子以不同形態存在，多糖溶液的濃度對WAM-1的分子鏈構象及鏈間相互作用形式產生影響，推測可能與WAM-1分子內、分子間的氫鍵締合作用有關。多糖濃度為10 μg/mL時，可清晰的觀察到WAM-1是以剛性鏈狀形態存在，且具有多分支結構。

白術多糖;分離純化;原子力顯微鏡

白術(Atractylodes macrocephala Koidz)，別名云術、山姜、冬白術等，為菊科多年生草本植物。白術是我國常用的中藥材之一，在中醫臨床上主要用于治療脾胃虛弱、汗出、胎動不安等，白術的干燥根莖，性溫味甘，具有健脾補胃、益氣生血、燥濕利水等功效［1］。白術含揮發油、內酯、多糖等成分，其中白術多糖經研究發現具有抗氧化、提高免疫力、降血糖、抗腫瘤等生物活性［2］。白術多糖是否具有生物活性主要取決于多糖的物理性質、一級結構、高級結構和立體構型等［3］，因此，對白術多糖的構象研究具有重要意義。

原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)是通過微小探針與樣品表面之間的相互作用來獲得各種材料表面結構形貌信息的儀器。具有原子級高分辨率(縱向分辨率:0.1 nm)，可以在大氣和液體環境下對各種材料和樣品的納米微區域進行觀測。現已廣泛應用于生物、化工、食品和醫藥研究中多種大分子鏈構象的分析研究［4］。AFM作為探索納米級微觀世界的有效手段，已經越來越多的被應用于多糖構象研究中［5，6］。本文采用DEAE-52纖維素層析柱和Sephadex G-200凝膠色譜對白術水提粗多糖進行分離純化，獲得均多糖WAM-1，并采用GC和AFM研究其單糖組分及分子形貌，同時探討濃度對WAM-1多糖微觀形貌的影響，為白術多糖的生物活性與構象關系的研究提供信息。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白術，產地浙江，購于西安市中藥材市場。

DEAE-52纖維素(Solarbio公司);Sephadex G-200(Pharmacia公司);D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖(sigma公司);其它試劑均為AR級。

Christ Alpha-4真空冷凍干燥機(德國 Marin Christ公司);SPM-9500J3型原子力顯微鏡(日本島津公司);氣相色譜儀(Agilent公司);高效液相色譜儀(Waters公司)。

1.2 白術多糖的提取、分離和純化

白術粗多糖AM的提取方法參照文獻［7］。取AM(100 mg)溶于蒸餾水(10 mL)，離心，上清液經DEAE-52纖維素柱層析初步分離，依次用蒸餾水、0.1、0.2 mol/L NaCl及0.3 mol/L NaCl溶液洗脫，流速為0.6 mL/min，DBS-100收集器進行收集，每管8 mL，苯酚-硫酸法檢測，收集各組分洗脫液，減壓濃縮后冷凍干燥。主峰多糖組分為蒸餾水洗脫所得組分，命名為WAM。取WAM(30 mg)溶于蒸餾水(5 mL)，離心，上清液再經Sephadex G-200凝膠過濾柱層析純化，蒸餾水為洗脫液，流速為0.3 mL/ min，每管收集3 mL，苯酚-硫酸法檢測，收集洗脫液，冷凍干燥得到多糖WAM-1。

1.3 WAM-1的純度鑒定

采用高效液相色譜法(HPLC)對WAM-1多糖進行純度鑒定。稱取WAM-1適量，配制1 mg/mL濃度多糖溶液，進行HPLC分析。色譜條件:Waters1525高效液相色譜系統，色譜柱為Shodex Ohpak SB-804 HQ，流動相為超純水，流速為0.8 mL/min，Wtaers2410示差折光檢測器，柱溫30℃，進樣量為20 μL。

1.4 WAM-1的單糖組分分析

稱取WAM-1(5 mg)置于具塞試管中，加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)，110℃水解4 h，取出后加入少量甲醇進行減壓濃縮，重復3次，以除盡TFA，得水解產物。在水解產物加入0.5 mL吡啶，10 mg鹽酸羥胺，2 mg肌醇六乙酰酯(內標)，置于90℃水浴鍋中反應30 min，取出冷卻至室溫，再加入0.5 mL無水乙酸酐，于90℃水浴繼續反應30 min，得糖腈乙酸酯衍生物［8］，之后進行GC色譜分析;以標準單糖的糖腈乙酸酯衍生物作對照。色譜條件:程序升溫，150～190℃，升溫速率7.0℃/min，190～250℃，升溫速率15℃/min;進樣溫度為280℃;檢測器溫度為260℃。

1.5WAM-1的AFM觀測

將干燥的樣品用去離子水溶解后，配成50、25和10 μg/mL溶液濃度梯度，置于磁力攪拌器持續攪拌4 h后，采用傳統滴加沉積法將樣品溶液滴在新剝離的云母表面［9］，室溫干燥，放置于AFM上對其分子形態進行掃描觀測。圖像均在contact模式下獲得，探針為Si3N4(微懸臂長:200 μm，彈性系數0.12 N/m)，原子力顯微鏡圖像的形態學特征(如高度、寬度等)均采用原子力顯微鏡附帶的軟件進行分析。

2 結果

2.1 WAM-1的純度鑒定

在WAM-1的HPLC譜圖中，該多糖的吸收峰為單一狹窄對稱峰，表明WAM-1為均多糖。

圖1 WAM-1的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of WAM-1

2.2 WAM-1的單糖組分分析

7種標準單糖的糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖及保留時間(RT)見圖2和表1。由圖2可見，各峰分離較好，基本無干擾現象。在WAM-1的糖腈乙酸酯的氣相色譜(圖3)中出現3個峰，通過與標準單糖的氣相色譜比照分析可知，1號峰為葡萄糖，2號峰為半乳糖，3號峰是內標峰。根據內標物的參比，由公式R1/2=f×(A1/A2)(其中f為校正因子，A為峰面積)計算得出，在WAM-1中葡萄糖和半乳糖的摩爾比為3.01∶1，說明WAM-1是一種由葡萄糖和半乳糖兩種單糖以3.01∶1的摩爾比例構成的雜多糖。

圖2 標準單糖的氣相色譜圖Fig.2 GC of mixed standard Monosaccharides

表1 標準單糖的保留時間Table 1 Retention time of standard monosaccharide

圖3 WAM-1的氣相色譜圖Fig.3 GC of WAM-1

2.3 WAM-1的AFM觀察結果

圖4a和4b分別為50 μg/mL的WAM-1不同放大倍數的原子力顯微鏡圖，可以看到，在疏水云母表面，WAM-1呈片狀，球狀等不規則形態，即使提高放大倍率，也沒有清晰細節，不能獲得多糖聚集體的微觀形貌特征，這可能是由于多糖濃度過大，羥基數目多，分子間的氫鍵締合作用強，多糖聚合較緊密，導致無法觀察多糖真實形態。

圖5a和5b分別為25 μg/mL的WAM-1不同放大倍數的原子力顯微鏡圖，由圖可見，WAM-1仍呈片狀，提高放大倍率后，但可以清楚的看見片狀中存在許多亮顆粒。通過和圖4比較，可以推測，多糖濃度降低，羥基數目減少，多糖分子間的締合作用減弱，有效的降低多糖的聚合程度，有利于觀察多糖的真實形態。

圖6a和6b分別為10 μg/mL的WAM-1不同放大倍數的原子力顯微鏡圖，圖6c為圖6b的三維形態。從圖中可以清晰地看到WAM-1以剛性分子鏈形態存在，且具有分支結構。利用原子力顯微鏡附帶軟件測得其單鏈高度在0.88～2.10 nm，寬度在51～110 nm范圍，寬度可能是由探針的加寬效應造成的。

圖6 WAM-1(10 μg/mL)的原子力顯微鏡圖Fig.6 AFM images of WAM-1(10 μg/mL)

3 討論

不同濃度WAM-1的原子力顯微鏡之間的區別表明，WAM-1分子間的相互作用和聚集度隨著多糖濃度的增加而增大。當溶液中WAM-1的濃度較小時，多糖分子間的相互作用較小，分子比較分散，當多糖濃度增大至一定程度時，多糖分子間相互作用增強，形成聚集態。

圖4和圖5中，觀察到WAM-1多糖的存在形態為大小不一，形態各異的聚集體。而圖6中，可以看到清晰穩定的WAM-1多糖多分支的分子鏈結構。多糖的結構很復雜，包括一級結構、高級結構及空間結構等，要想得到更多的結構信息要配合使用其它的儀器分析方法和物理化學方法，如部分酸水解、高碘酸氧化、史密斯降解、NMR、GC-MS等，這樣就能得出WAM-1主鏈及側鏈的組成。本實驗結果提示，在采用原子力顯微鏡觀察多糖的微觀形貌時，應注意樣品的濃度。多糖樣品的濃度會對其形態產生顯著的影響，采用較高濃度的多糖溶液時，容易形成聚集體，而較低濃度的多糖溶液則可以避免聚集體的產生。如果濃度過大，可能影響大分子的形態，導致無法觀察到多糖本身的結構。

1 National Pharmacopoeia Committee(國家藥典委員會).Chinese Pharmacopoeia(中國藥典)，Vol.Beijing:Chemical Industry Press，2005.68.

2 Cao G(曹崗)，Zhang XY(張曉炎)，Cong XD(叢曉東)，et al.The research progress of polysaccharides fromAtractylodes macrocephalaKoidz.J Beijing Union Univ，Nat Sci(北京聯合大學學報，自然科學版)，2009，23:14-18.

3 Thulasi GP，Cherupally KN，Janardhanan KK.Polysaccharides isolated fromGanoderma lucidumoccurring in Southern parts of India，protects radiation induced damagers both in vitro and in vivo.Environ Toxicol Pharmacol，2008，26:80-85.

4 Zhao JW(趙健偉)，Wang N(王楠).Electricity characterization of metalloprotein at molecular level by conducting atomic force microscopy.Chem J Chin Univ(高等學校化學學報)，2005，26:751-753.

5 Liu RH(劉榮華)，Yang XF(楊小凡)，Chi AP(池愛平).Atomic force microscopy observation ofGynostemma pentaphyllumpolysaccharide GPPⅢ-a.Food Sci(食品科學)，2009，30:76-78.

6 Sun RG(孫潤廣)，Zhang J(張靜).A study of helical structure of glycyrrhiza polysaccharide by atomic force microscopy.Acta Chim Sin(化學學報)，2006，64:2467-2472.

7 Li X(李昕)，Zhang J(張靜).Optimization of the extraction water-soluble polysaccharides fromAtractylodes macrocephalaKoidz by orthogonal rotatable central composite design.Sci Technol Food Ind(食品工業科技)，2009，30:161-164.

8 Zhang WJ(張惟杰).Biochemical Techniques Study on Carbohydrate Compound(糖復合物生化研究技術).Zhejiang University Press，2003.38-40.

9 Wilkinson KJ，Balnois E，Leppard GG，et al.Characteristic features of the major components of freshwater colloidal organic matter revealed by transmission electron and atomic force microscopy.Colloids Surf A，1999，155:287.

Chromatographic Analysis and Atomic Force Microscope Observation of Polysaccharide Extracted from Atractylodes macrocephala Koidz.

WU Le-qin，JIANG Shao-fen，ZHANG Jing*
College of Food Engineering and Nutrition Science，Shanxi Normal University，Xi’an 710062

Polysaccharides extracted from the stem ofAtractylodes macrocephalaKoidz by hot water，were fractionated by DEAE-52 cellulose chromatography，and purified by Sephadex G-200 gel filtration chromatography to obtain a fraction，named WAM-1.HPLC and GC analysis showed that WAM-1 was a homogeneous and consisted of glucose and galactose in the molar ratio of 3.01∶1.The molecular morphology of WAM-1 was observed under an atomic force microscope (AFM).The results showed that WAM-1 existed in different forms with different concentrations.The concentration of polysaccharide had effects on the conformation and form of chain interactions，which might be related to the interaction of intramolecular and intermolecular hydrogen bonds.At 10 μg/mL，the morphology of WAM-1 was observed clearly in rigid chains with many branches.

polysaccharide;purification;atomic force microscope

R284.2

A

1001-6880(2012)05-0631-05

2010-10-15 接受日期:2011-04-22

國家自然科學基金項目(10874108);陜西省自然科學基礎研究計劃(SJ08A16)

*通訊作者 E-mail:zhangjin@snnu.edu.cn