11-脫氧18α-和18β-甘草次酸類抗癌復合物的制備和結構表征

木合布力·阿布力孜，閔 杰，鄭大成，馬紅艷，熱娜·卡斯木

新疆醫(yī)科大學藥學院藥物化學有機教研室，烏魯木齊 830011

11-脫氧18α-和18β-甘草次酸類抗癌復合物的制備和結構表征

木合布力·阿布力孜，閔 杰，鄭大成，馬紅艷，熱娜·卡斯木*

新疆醫(yī)科大學藥學院藥物化學有機教研室，烏魯木齊 830011

為尋找新型肝靶向抗癌前藥，將具有肝靶向特征的天然分子甘草次酸的半合成衍生物與抗癌藥環(huán)磷酰胺的活性代謝物氮芥磷酰二氯偶聯制成11-脫氧甘草次酸類兩個目標化合物和7個中間體。化合物的化學結構用常規(guī)光譜分析法進行鑒定，對合成工藝、理化性質和光譜特征進行系統(tǒng)描述。本研究對甘草次酸類新型肝靶向抗癌前藥的藥理活性篩選奠定基礎。

11-脫氧甘草次酸類;氫化還原;構型轉化;11-脫氧18α-和18β-甘甲磷酰氮芥酯;結構表征

靶向前藥在提高化療藥物在癌組織中的局部濃度，降低全身性毒副作用以及降低耐藥性方面具有明顯優(yōu)勢，從而成為新型抗癌藥物研究熱點［1］。中藥甘草(Glycyrrhiza inflata)有效成分甘草甜素的苷元甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)具有較強的抗氧化和保肝活性［2，3］，同時具有良好的肝組織分布特征和肝細胞靶向性［4-6］，并促進癌肝癌細胞凋亡［7］。這些研究結果顯示，甘草次酸及其衍生物具有作為運載肝病治療藥物的肝靶向載體使用的潛力，與抗癌藥物偶聯成肝靶向前藥，在新型靶向抗癌藥物的設計和研究中具有較好的前景。目前，甘草次酸的假醛固酮增多癥副作用限制它的廣泛藥用［8］，研究表明，在甘草次酸分子結構中，消除C11-位上氧原子的衍生物無此副作用［9，10］。

本文作者在前期研究的基礎上［2］，利用甘草次酸的肝靶向性、抗氧化保肝作用和促進肝癌細胞凋亡等特點，以甘草次酸為起點，經化學修飾獲得其11-脫氧的衍生物，再將它做為肝靶向化學載體，與抗癌藥物環(huán)磷酰胺的活性代謝產物——氮芥磷酰二氯相連接，制成具有肝靶向潛能的抗癌前藥復合物。作為載體的甘草次酸具有兩種光學異構體，其中18α-甘草酸的肝組織分布能力比18β-甘草酸要更強［5］，但18α-體的天然來源非常有限，植物中含量甚微。因此，本研究中先對18β-甘草次酸進行構型轉化，制成其光學異構體18α-甘草次酸，再合成了相關目標化合物。關于兩個目標化合物的結構信息未見文獻報道。本文對各化合物的理化性質和光譜特征進行系統(tǒng)研究并詳細描述，以便為深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

定性鑒別用 TLC板(Silica gel 60 F254，MERCK)，制備型 TLC板(Silica gel 60 F254，MERCK)，WRS-1A型數字式熔點測定儀，核磁共振儀(1H NMR，Varian-600，CDCl3)，紅外光譜儀(IR，MERCK，樣品用KBr壓片)，UV儀(UV Kontron);質譜儀(MS quadripolar VG Platform II)。

18β-甘草次酸和18α-甘草次酸標準品(98%，Acros Organic，France)，18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid，新疆天山制藥有限公司提供)，其它化學試劑均為分析純。

1.2 合成方法

化合物的合成方法見圖1。以18β-甘草次酸(I)為起始化合物，經鋅粉鹽酸還原得11-脫氧18β-甘草次酸(II)，經甲酯化反應的化合物III，經I的C18位β-氫的構型轉化獲得光學異構體18α-甘草次酸(IV);經同法還原和甲酯化得11-脫氧18α-甘草次酸(V)及其甲酯(VI);將III和VI分別與抗癌藥環(huán)磷酰胺的活性代謝產物氮芥磷酰二氯(VII)偶聯，獲得兩個目標化合物11-脫氧18α-和11-脫氧18β-甘草次酸甲磷酰氮芥酯(VIII和IX)。結構均以1H NMR、IR、MS和UV等常規(guī)方法進行鑒定。

圖1 甘草次酸衍生物的合成路線Fig.1 Synthesis pathway of glycyrrhetinic acid derivatives

化合物II的制備:將18β-甘草次酸(I)0.45 g溶于無水乙醇100 mL中，加入鋅粉9.0 g，加熱回流，1 h內滴入鹽酸80 mL，并滴加無水乙醇至反應液澄清，繼續(xù)回流2 h，過濾，濾液中加蒸餾水至出現沉淀，水浴加熱至沉淀完全溶解，4℃放置24 h后抽濾，得白色粗品沉淀，用甲醇重結晶，得精品0.28 g，產率62%。

化合物III、IV和V的制備:III、IV和V均按照我們前期發(fā)表論文［11］中的方法進行制備，產率分別為28%、45%和25%。

化合物VII的制備:VII(氮芥磷酰二氯，nitrogen mustard dichlorophosphate，簡稱 DCPNM)按文獻［12］的方法，將二乙醇胺與三氯氧磷反應而獲得，產率32%。

化合物VIII的制備:取50 mL的三口圓底燒瓶，加入化合物IV 2.00 g和V 1.4 g，溶解于20 mL無水氯仿中，加入5 mL無水吡啶，加溫回流3～4 h，用TCL檢測反應進程。將產物用50 mL氯仿萃取三次，用無水MgSO4干燥，減壓蒸除氯仿，粗品用硅膠柱層析進行分離純化(乙酸乙酯/石油醚)，并用石油醚(bp90-120℃)和丙酮混合液重結晶得精品，產率23%。

化合物IX的制備:IX按以上方法(同VIII)進行制備，產率28%。

此外，經簡單的因素分析經驗，對以上兩種目標化合物的制備工藝進行考察，并發(fā)現磷酰酯化反應條件應控制為無水條件、配料比1∶1.35、65℃/3-4 h，此時反應穩(wěn)定進行，產率較高，經TLC檢測的副反應發(fā)生率低。

2 結果

18β-甘草次酸(I):3β-hydroxy-11-oxo-18β-olean-12-en-30-oic，白色粉末狀晶體，難溶于水，溶于乙醇，易溶于氯仿、熱甲醇和熱乙醇，微溶于丙酮。mp 296～298℃ (EtOH)，+135(c 1.0，EtOH); IR(KBr)νmax3440，3046，2943，1666，1018 cm-1;1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:0.83(3H，s，H-28)，0.86 (3H，s，H-24)，1.03(3H，s，H-26)，1.15(3H，s，H-23)，1.16(3H，s，H-25)，1.25(3H，s，H-29)，1.39 (3H，s，H-27)，2.37(1H，s，H-9)，2.81(2H，dt，J= 3.2，13.6 Hz，H-1)，3.26(1H，dd，J=5.8，10.8 Hz，H-3)，5.73(1H，s，H-12).EI-MS(neg.)m/z:470.7［M］+。以上數據與我們前期發(fā)表論文一致［13］。

11-脫氧-18β-甘草次酸(II):3β-hydroxy-18βolean-12-en-30-oic，白色針狀結晶，溶于熱甲醇和氯仿，二氯甲烷，微溶于無水乙醇和乙酸乙酯，不溶于水，mp 328.1-330.6℃;IR(KBr)νmax3439，2974，2926，2876，1707，1383，1366 cm-1(1666 cm-1處共扼碳基峰消失);1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:0.76 (3H，s，28-H)，0.77(3H，s，23-H)，0.96(3H，s，25-H)，0.97(3H，s，26-H)，0.98(3H，s，24-H)，1.01(3H，s，29-H)，1.11(3H，s，27-H)，3.13( 1H，m，3-H)，5.24(1H，t，12-H)。EI-MS m/z: 456.7［M］+。以上數據與文獻［14］報道一致。

11-脫氧-18β-甘草次酸甲酯(III):30-methyl-3βhydroxy-18β-olean-12-en-30-oic，白色針狀結晶，溶于熱甲醇、氯仿，微溶于無水乙醇和乙酸乙酯，不溶于水，mp 292.1-294℃;+124(c 1.0，EtOH); IR(KBr)νmax3 352，2943，1722，1466，1387，1323，1215，1159 cm-1;1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:0.74～1.35(21H，m，7×CH3)，2.02(3H，s，CH3CO)，4.60(1H，t，J=9.0 Hz，H-3)，5.24(1H，s，Δ12-H); EI-MS m/z:470.71［M］+。1H NMR譜圖中出現了δ =3.67 ppm的甲氧基峰，而δ=12 ppm的羧基峰消失。IR譜圖1220 cm-1左右處出現酯基的VC-O-C中強吸收帶。綜合上述分析，并結合文獻［14］數據，鑒定其為11-脫氧-18β-甘草次酸甲酯。

18α-甘草次酸(IV):3β-hydroxy-11-oxo-18αolean-12-en-30-oic，易溶于氯仿、熱甲醇和熱乙醇，微溶于丙酮，不溶于水。mp 330.8～331.2℃(文獻值330-335℃［15］)，+74.5(c 1.0，EtOH)，產率45% (文獻值 20%［15］);IR(KBr)νmax3496，2969，2926，2867，1704，1661，1297，1200，1112，1028，989，658 cm-1.1H NMR(DMSO-d6，600 MHz) δ:0.64-0.68(m，H-7，H-5，H-24，H-28)，0.89(s，3H，H-23)，0.93-0.99(m，1H，H-1)，1.03(s，3H，H-26)，1.08(s，3H，H-25)，1.15(s，3H，H-29)，1.43(m，2-H，H-22)，1.46(m，2-H，H-19)，1.47 (m，2H，H-16)，1.49(m，2H，H-15)，1.51(m，2H，H-7)，1.56(m，2H，H-6)，1.62(m，2H，H-2)，1.66 (m，H-2，H-21)，1.77(dt，J=13.8，3.6 Hz，1H，H-21)，1.88(dt，J=13.3，3.8 Hz，1H，H-15)，2.25～2.28(m，2H，H-9，H-18)，2.45(d，J=13.3 Hz，1H，H-1)，3.00(dd，J=10.8，3.5 Hz，1H，H-3)，5.32 (s，1H，H-12);EI-MS m/z:470.7［M］+。以上數據與文獻［15］相符。

11-脫氧-18α-甘草次酸(V):3β-hydroxy-18αolean-12-en-30-oic，白色針狀結晶，溶于熱甲醇和氯仿，二氯甲烷，微溶于無水乙醇和乙酸乙酯，不溶于水，mp 328.1～330.6℃;IR(KBr)νmax:3439，2974，2926，2876，1707，1383，1366(齊墩果烷型五環(huán)三萜骨架A區(qū)的兩特征峰)，1308，1217，1177(齊墩果烷型五環(huán)三萜骨架 B區(qū)的三特征峰)cm-1，1666 cm-1處共扼碳基峰消失;1H NMR(CDCl3，600 MHz) δ:0.66(3H，s，H-28)，0.74(3H，s，H-23)，0.85 (3H，s，H-25)，0.88(3H，s，H-26)，0.93(3H，s，H-24)，1.01(3H，s，H-29)，1.11(3H，s，H-27)，3.13 (1H，m，H-3)，5.17(1H，s，H-12);EI-MS m/z:456.7［M］+。以上特征與文獻報道［15］的相符。

11-脫氧-18α-甘草次酸甲酯(VI):30-methyl-3β-hydroxy-18β-olean-12-en-30-oic，白色針狀結晶，溶于熱甲醇、二氯甲烷和氯仿，微溶于無水乙醇和乙酸乙酯，不溶于水，mp 292.1-294℃，+74.5 (c 1.0，EtOH);IR(KBr)νmax2940，1720，1700，1460，1370，1245，1215，1150 cm-1，IR譜圖1220 cm-1左右處出現酯基的 νC-O-C中強吸收帶。1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:0.71～1.36(21H，m，7× CH3);2.11(3H，s，CH3CO);4.16(1H，t，J=9Hz，C3-H);5.18(1H，s，Δ12-H)，1H NMR譜圖中出現了δ=3.685 ppm的甲氧基峰，而δ=12.18 ppm的羧基峰消失。EI-MS m/z:470.7［M］+.綜合上述分析，并結合文獻［15］數據鑒定為11-脫氧-18α-甘草次酸甲酯。

氮芥磷酰二氯(VII):nitrogen mustard dichlorophosphorous(DCPNM)，無色片狀結晶，質重，有光澤。易溶于乙醇和丙酮，微溶于石油醚。熔點:mp 51～53℃;IR(KBr)νmax:2960，1361，1199，1116，983，891，777，555 cm-1;1H NMR(acetone-d6，600 MHz)δ:3.74～3.77(4H，t，J=13.2 Hz，2×-CH2N)，3.89(4H，t，J=12.6 Hz，2×-CH2Cl2);EIMS m/z:［M］+258.9;以上特征與文獻值相符［12］。

11-脫氧-18α-甘草次酸甲酯-磷酰氮芥酯(VIII):又名N，N-二(氯乙基)-3β-O-18α-甘草亭酸甲酯基磷酰胺單酯，為白色粉末，溶于氯仿，乙酸乙酯，石油醚和甲醇，mp 137.6～141.2℃;IR(KBr)νmax: 2972，1728，1660，1454，1280，1193，1112，983 cm-1;1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:0.70(3H，s，H-23)，0.86-0.87(7H，m，H-5，H-24，H-28)，1.04 (3H，s，H-26)，1.12(3H，s，H-25)，1.20(3H，s，H-29)，1.21-1.62(17H，m，H-2，H-6，H-7，H-15，H-16，H-19，H-22，H-27)，1.90(1H，m，H-15)，2.01(1H，m，H-21)，2.13(1H，m，H-18)，2.24(1H，m，H-9)，3.41(4H，t，J=9.6 Hz，2×-CH2N)，3.56(4H，t，J= 12.6 Hz，2×-CH2Cl2)3.69(3H，s，-COOCH3)，4.82 (1H，s，-O-CH)，5.56(1H，s，H-12);EI-MS m/z:［M］+674.6。

IR譜圖中除了存在18α-甘草次酸甲酯的1660 cm-1的吸收峰和1728 cm-1的酯基吸收峰兩個特征峰外，還出現了2972 cm-1處的-P-OH吸收峰，1193 cm-1處的P=O吸收峰，1123 cm-1處的P-O-C吸收峰和 983 cm-1處的 P-N吸收峰。此外，在1H NMR譜圖中，除了出現18α-甘草次酸甲酯的δ= 3.37 ppm的甲氧基信號峰外，還出現了 δ=3.41 ppm和δ=3.56 ppm的-CH2N和-CH2Cl2信號峰。綜合上述分析，結合該結構的理化性質特征，鑒定為11-脫氧-18α-甘草次酸甲酯-磷酰氮芥酯。

11-脫氧-18β-甘草次酸甲酯-磷酰氮芥酯(IX):又名N，N-二(氯乙基)-3β-O-18β-甘草亭酸甲酯基磷酰胺單酯，為白色粉末，溶于氯仿，乙酸乙酯，石油醚和甲醇，mp 168.4～171.2℃;IR(KΒr)νmax: 2951，1732，1660，1386，1282，1213，1153，983 cm-1;1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:0.77(3H，m，28-H)，0.80(3H，s，H-23)，0.83(3H，m，24-H)，0.85 (1H，m，5-H)，1.05(3H，s，26-H)，1.03-1.08(1H，m，1-H)，1.09(3H，s，25-H)，1.15(3H，s，29-H)，1.26-1.66(17H，m，2-H，6-H，7-H，15-H，16-H，19-H，22-H，27-H)，1.81(1-H，m，21-H)，1.87(1H，m，15-H)，1.92(1-H，m，18-H)，1.95(1H，m，9-H)，3.37(3H，s，-COOCH3)，4.21(1H，s，-O-CH)，5.66 (1H，s，H-12);EI-MS m/z:［M］+674.6。

IR譜圖中除了存在18β-甘草次酸甲酯的1660 cm-1的吸收峰和1732 cm-1的酯基吸收峰兩個特征峰外，還出現了2951 cm-1處的-P-OH吸收峰，1213 cm-1處的P=O吸收峰，1153 cm-1處的P-O-C吸收峰和983 cm-1處的 P-N吸收峰。此外，在1H NMR譜圖中，除了出現18β-甘草次酸甲酯的 δ= 3.69 ppm的甲氧基信號峰外，還出現了 δ=3.42 ppm和δ=3.54 ppm的-CH2N和-CH2Cl2信號峰。綜合上述分析，結合該結構的理化性質特征，鑒定為11-脫氧-18β-甘草次酸甲酯-二氯磷酰氮芥酯。

3 討論

從天然產物中尋找與特定組織細胞具有親和力的靶向載體在有效低毒的新型靶向抗癌藥物設計研究中具有一定優(yōu)勢。人們曾利用內源性天然分子膽酸的肝細胞靶向特點，將抗癌化療藥物與之偶聯制成一系列小分子肝靶向抗癌藥物并投入臨床使用，在肝癌的治療中獲得明顯進展［1］。雖然膽酸的來源昂貴，然而此成果促使人們從天然產物中尋找小分子靶向載體，以促進新型肝靶向藥物的設計和篩選研究。

本研究中，利用天然三萜類分子甘草次酸的肝靶向性和促進肝癌細胞凋亡的特征，以18β-甘草次酸為起點，經半合成制備其11-脫氧衍生物，同時對各光學異構體進行構型轉化，再與抗癌藥環(huán)磷酰胺的活性代謝產物——氮芥磷酰二氯偶連而獲得目標化合物，并對各化合物的化學結構用常規(guī)光譜分析法進行鑒定，對制備工藝、理化性質和光譜特征進行系統(tǒng)描述，為將來的藥理實驗研究奠定基礎。本文作者對甘草次酸衍生物及其與磷酰氮芥二氯偶聯的衍生物所進行的初步藥理實驗結果顯示，甘草次酸的構型轉化及與抗癌基團偶聯能顯著提高抗癌活性。人類肝癌細胞Bel-7402對本類化合物顯示良好的敏感性［16］。本研究在新型肝靶向抗癌新藥的設計和深入研究中將有一定的參考價值。

1 Monica G，Maria C，Rocio I.R，et al.Relationship between tumor cell load and sensitivity to the cytostatic effect of two novel platinum-bile acid complexes，bamet-D3 and bamet-UD2.J Drug Targ，2002，10:397-404.

2 Ablise M，Leininger-Muller B，Wong CD，et al.Synthesis and in vitro antioxidant activity of glycyrrhetinic acid derivatives tested with the cytochrome P450/NADPH system.Chem Pharm Bull(Tokyo)，2004，52:1436-1439.

3 Hye GJ.Sung JP，Ae RM，et al.Hepatoprotective effects 18βglycyrrhetinic acid on carbon tetrachloride-induced liver injury:inhibition of cytochrome P450 2E1 expression.Pharm Res，2002，46:221-227.

4 Negishi M，Irie A，Nagata N，et al.Specific binding of glycyrrhetinic acid to the liver membrane.Biochim.Biophys Acta，1991，1066:77.

5 Fan Y(范益)，Ding JH(丁建花)，Liu SY(劉蘇怡)，et al.Studies on distribution in mice tissues of α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid.Chin J Clin Pharm Ther(中國臨床藥理學與治療學)，2004，9:619-622.

6 Cha RT(查瑞濤)，Du T(杜田)，Yuan Z(袁直).Syntheses and characterization of poly(γ-benzyl-L-glutamate)containing liver targeting group in main chain.Chem J Chin Univ(高等學校化學學報)，2006，27:885-887.

7 Huang W(黃煒)，Huang JQ(黃擠群)，Zhang DF(張東方)，et al.All-trans-retinoic acid，18β-glycyrrhetinic acid and glycyrrhizic acid induced differentiation and apoptosis of human hepatoma cells.Chin J Integ Trad West Medn Liv Dis(中西醫(yī)結合肝病雜志)，2003，13:148-150.

8 Gaware R，Khunt R，Czollner L，et al.Synthesis of new glycyrrhetinic acid derived ring A azepanone，29-urea and 29-hydroxamic acid derivatives as selective 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2 inhibitors.Bioorg Med Chem，2011，19: 1866-1880.

9 Vicker N，Su X，Lawrence H，et al.A novel 18β-glycyrrhetinic acid analogue as a potent and selective inhibitor of 11βhydroxysteroid dehydrogenase 2.Bioorg Med Chem Lett，2004，114:3263-3267.

10 Su X，Lawrence H，Ganeshapillai D，et al.A novel 18β-glycyrrhetinic acid analogues as a potent and selective inhibitors of 11β-hydroxysteroid dehydrogenases.Bioorg Med Chem，2004，12:4439-4457.

11 Mourboul ABLISE(木合布力.阿布力孜)，Min J(閔杰)，Rena KASIMU(熱娜.卡斯木)，et al.Preparation of 18αglycyrrhetinic acid and its methyl ester.Northwest Pharm J(西北藥學雜志)，2009，24:58-59.

12 Li ZG(李在國).Organic Synthesis Intermediate Products.Chemical Industry Press(Beijing)(化學工業(yè)出版社)，2002，August，2nd Edition，p127，185.

13 Mourboul ABULIZI，Ma SY(馬淑燕)，Rena KASIM，et al.Synthesis and in vitro antioxidant activity of homo and heterocyclic diene derivatives of glycyrrhetol.Acta Pharm Sin(藥學學報).2008，43:719-722.

14 Xie SM(謝松梅)，Cui HF(崔慧斐)，Zang HC(臧恒昌).The preparation of deoxy-glycyrrhetinic acid.Chin J Biochem Pharm(中國生化藥物雜志)，2007，28:74-76.

15 Ignatove DV，Prokofev IUL，Ipatova OM，et al.A simple method for preparation of 18 alpha-glycyrretinic acid ant its derivatives.Bioorg Khim.2003，29:429-33.

16 Mourboul ABLISE，Chang zhi DONG，Rena KASIM，et al.Synthesis and in vitro anticancer property of glycyrrhetinic acid derivatives towards human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402.47th International Conference of Medicinal Chemistry，2011，Jul 6-8，Lyon France(RICT 2011).

Preparation and Characterization of Anticancer Conjugates 11-deoxo-18α and 18β-Glycyrrhetinic Acid Derivatives

Mourboul ABLISE，MIN Jie，ZHENG Da-cheng，MA Hong-yan，Rena KASIM*
Department of Medicinal and Organic Chemistry，College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China

To obtain new anticancer prodrugs on the bases of hepatocell targeting property of natural product glycyrrhetinic acid and its semi-synthetic derivatives，we prepared two conjugated products by the route of coupling 11-deoxo-glycyrrhetinic acid derivatives with nitrogen mustard dichlorophosphate(the active metabolite of anticancer drug cyclophosphamide).The structure of two target compounds and 7 intermediate products was characterized by routine spectrometric methods;the technologies of preparation and physical-chemical properties were studied.This work may provide substantial bases for further pharmacological screening of new anticancer products from glycyrrhetinic acid derivatives with hepdirecting potency.

18β-glycyrrhetinic acid;chemical reduction;epimerization;11-deoxo-18α and 18β-methy glycyrrhetinic acidphosphorus nitrogen mustard ester;characterization

R284.2

A

1001-6880(2012)05-0648-05

2011-06-27 接受日期:2011-10-09

國家自然科學基金項目(30960461)

*通訊作者 Tel:86-991-4362473;E-mail:renakasimu@vip.sina.com