椰子種皮油提取物對低密度脂蛋白氧化的抑制作用

趙曉莉，陳衛軍，趙松林，張春梅，王 妨

1中國熱帶農業科學院椰子研究所產品加工研究室，文昌 571339;2海南大學食品學院，海口 570228

椰子種皮油提取物對低密度脂蛋白氧化的抑制作用

趙曉莉1，2，陳衛軍1*，趙松林1，張春梅1，王 妨2

1中國熱帶農業科學院椰子研究所產品加工研究室，文昌 571339;2海南大學食品學院，海口 570228

本文研究了椰子種皮油提取物對低密度脂蛋白氧化的抑制作用，以水溶性VE(Trolox)作為對照，測定椰子種皮油提取物的總酚含量，總抗氧化能力，檢測提取物對低密度脂蛋白的氧化易感性，硫代巴比妥酸反應產物(TBARS)值及銅絡合能力的影響。結果表明，椰子種皮油提取物的總酚含量為68.6 mg/g，總抗氧化能力也隨著濃度增大而加強，說明該提取物具有較好的抗氧化活性。濃度為0.5 mg/mL的提取物能將低密度脂蛋白的延滯時間延長了兩倍，丙二醛(MDA)含量也明顯下降，表明椰子種皮油提取物對低密度脂蛋白的氧化具有一定的抑制作用。

椰子種皮油提取物;低密度脂蛋白;TBARS;脂質過氧化;銅絡合

低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)是人體血漿中攜帶大量膽固醇的主要蛋白質，也含有大量亞油酸和花生四烯酸等不飽和脂肪酸，這些成分極易氧化變性而成為過氧化物，氧化LDL不再能結合到LDL受體上，而是與巨噬細胞的清除受體相結合，并形成泡沫細胞，是導致動脈粥樣硬化的主要原因［1-3］。因此，如何抑制LDL的氧化，成了目前研究的熱門課題。

椰子種皮(coconut testa)是椰子硬殼內椰肉上附著的一層薄皮，成熟時呈黑褐色，一般作為椰子加工過程中的副產物。種皮中也含有一定量的油脂，但椰子種皮油(coconut testa oil)一般作為工業用油，經濟效益較低，但是據文獻報道，帶種皮的椰子油中富含多酚及其他活性物質［4］。本文主要是體外利用Cu2+誘導LDL氧化，研究了椰子種皮油提取物(coconut testa oil extracts)對LDL氧化的抑制作用，為椰子種皮油的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

椰子種皮，自制，椰子采自于中國熱帶農業科學院實驗基地。

LDL、水溶性維生素E(6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid，Trolox)、福林酚試劑購于美國Sigma公司。

甲醇(西隴化工股份有限公司);異丙醇、氯化銅、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉(廣州化學試劑廠);三氯乙酸(Trichloroacetic acid，TCA)(天津福辰化學試劑廠);2-硫代巴比妥酸(2-Thiobarbituric acid，TBA)和二乙烯三胺五乙酸(Diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)(國藥集團化學試劑有限公司)。T-AOC總抗氧化能力試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

UVLINE9400紫外可見分光光度計，BECKMAN高速冷凍離心機，超聲波清洗儀，恒溫水浴鍋，R-210旋轉蒸發儀。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 椰子種皮油(CTO)的制備

新鮮椰子種皮，烘干，打碎，取種皮50 g，加入200 mL異丙醇，60℃，超聲波輔助提取3 h，真空抽濾，旋轉蒸發除去溶劑，即得椰子種皮油。

1.2.1.2 椰子種皮油提取物(CTOE)的制備

［5］的方法，略加改進。取椰子種皮油50 g，加入10 mL 80%甲醇(甲醇/水，v:v，8∶2)，超聲波輔助提取10 min，然后離心，2000×g，30 min，收集上層清液，重復提取三次，合并清液，40℃旋轉蒸發，除去甲醇，然后冷凍干燥。總酚含量采用福林-酚法測定，提取物的總酚含量為68.6 mg/g。

1.2.2 提取物抑制LDL氧化能力的測定

1.2.2.1 銅誘導LDL氧化(氧化動力學)

參考文獻［6］的方法，略加改進。用10 mM pH 7.4的PBS(磷酸鹽緩沖液)將LDL濃度稀釋至100 μg/mL。取該濃度的LDL 100 μL，加入同體積濃度為0.5 mg/mL提取物/Trolox，混勻，于37℃水浴中水浴30 min，然后加入50 μL濃度為50 μM的CuCl2，用10 mM pH 7.4的PBS補充體積至1 mL，于234 nm處測試吸光值，每2 min讀數一次，共掃描8 h。濃度為1.0、1.5、2.0和2.5 mg/mL的提取物及Trolox，也分別按照上面的步驟，每個濃度3個平行，以不加提取物的組作為空白。

1.2.2.2 TBARS的測定

本實驗通過測定硫代巴比妥酸反應物(TBARS)來評定LDL脂質過氧化程度。參考文獻［7］，并加以改進。取100 μg/mL的LDL100 μL，加入同體積的各濃度的提取物/Trolox，37℃水浴30 min后，加入50 mM的CuCl250 μL，再置于37℃水浴反應10 h后，加入1 mL 20%的三氯乙酸(TCA)，1 mL 1%的硫代巴比妥酸(TBA)，沸水浴30 min，冷卻后于532 nm處測吸光值，以不加TBA作為空白。

1.2.3 提取物與銅絡合能力測定

1 mL各濃度的提取物，加入250 μL 5 mM的CuCl2，37℃水浴30 min，再加入1 mL 10 mM的DTPA，做全波長掃描，從190 nm到850 nm，以不加DTPA作為空白［6］。

1.2.4 提取物總抗氧化能力的測定

本實驗采用鐵離子還原法(ferric reducing/antioxidant power assay，FRAP)測定總抗氧化能力，Fe3+-吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ)可被樣品中的還原物質還原為Fe2+，呈現出藍色，并于593 nm處有最大吸收，根據吸光度的大小計算樣品抗氧化活性的強弱。本次實驗采用總抗氧化能力試劑盒，濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，取樣量為0.1 mL。

總抗氧化能力=［(ODU-ODC)/0.01］÷30×N

O DU——測定管吸光度值

O DC——對照管吸光度值

N——反應體系稀釋倍數(反應液總體積/取樣量)

1.3 數據分析

所有的數據均用Excel和SPSS11.5軟件處理，差異顯著性水平為P＜0.05，平均數之間的多重比較使用鄧肯新復極差檢驗方法(DMRT)。

2 結果

2.1 椰子種皮油提取物對LDL氧化易感性的影響

圖1 椰子種皮油提取物對LDL氧化過程中共軛二烯形成的影響示意圖Fig.1 Influence of CTOE on copper-induced formation of conjugated dienes(CD)in LDL

對Cu2+誘導的LDL氧化過程進行了8 h的掃描。LDL中的多不飽和脂肪酸容易被氧化，氧化后形成共軛二烯(conjugated dienes，CD)，CD在紫外區有吸收，在波長234 nm處有最大吸收峰，脂質過氧化程度越高，其吸光度數值越大，因此CD值可以作為判斷LDL氧化的指標［8］。按CD產生的量隨時間變化來繪制LDL氧化曲線，如下圖，從樣品開始被氧化到過氧化反應加速這個階段被稱為延滯期，延滯階段與增殖階段的切線交點所對應的X軸的時間值就是延滯時間［9］，如圖1所示。通過對比模型的延滯時間來判斷樣品的抗脂質過氧化能力。

結果如表1所示，相同條件下，100 μL 0.5 mg/ mL的提取物加入后，延滯時間延長至40 min，明顯延緩LDL氧化，而且隨著樣品濃度的增大，其延滯時間越來越長，說明其抑制LDL氧化的能力隨著濃度增大而加強，但效果略低于Trolox。

表1 椰子種皮油提取物對LDL氧化滯后時間的長短的影響(n=3，±s)Table 1 The effect of CTOE on lag time in the oxidation process of LDL(n=3，±s)

表1 椰子種皮油提取物對LDL氧化滯后時間的長短的影響(n=3，±s)Table 1 The effect of CTOE on lag time in the oxidation process of LDL(n=3，±s)

注:同一列中字母不同表示差異顯著(P＜0.05)Note:In the same column，the different letter means significant difference (P＜0.05)

組別Group濃度(mg/mL) Concentration延滯時間(min) Lag time空白組Blank group 0 19±2.08k0.5 40±2.52j樣品組Sample group 1.0 92±1.15h1.5 157±2.08f2.0 230±1.53d2.5 284±2.08b0.5 50±2.65i對照組Control group 1.0 136±1.53g1.5 189±2.08e2.0 217±2.08c2.5 276±2.08a

圖2 椰子種皮油提取物對LDL氧化過程中TBARS產物的抑制作用Fig.2 nhibitory effect of CTOE on production of TBARS in Cu2+-mediated oxidation of LDL

2.2 椰子種皮油提取物對LDL脂質過氧化程度的影響

A532的值大小表明MDA的含量多少，從表2可以看出，在37℃下反應10 h后，在氧化體系中加入樣品后，從0.5 mg/mL到2.5 mg/mL，其吸光值越來越小，表明生成的MDA越來越少，說明椰子種皮油提取物對于LDL氧化的抑制呈劑量依賴性，與抑制LDL氧化動力學實驗呈現的趨勢相同。

2.3 提取物銅絡合能力

提取物與銅離子絡合后，加入DTPA絡合剩余的銅離子，從圖3可以看出，Cu2+與DTPA的絡合物在287 nm附近有最大吸收，因為酚類化合物在280 nm之前有吸收但低于最大吸收峰，所以250 nm之前混合物的吸收圖譜未呈現在圖3中。

圖3 提取物與Cu2+絡合能力Fig.3 The copper chelating capacities of CTOE

圖3呈現的是從250 nm到340 nm的吸光值，據文獻報道［6］，Cu2+與DETAPAC(二乙烯三胺五乙酸酐)絡合物在650 nm附近有最大吸收峰，但本實驗中并沒有發現。吸收峰值越大，表明Cu2+與DTPA的絡合物越多，即提取物絡合能力越弱。結果如圖3所示，由上往下依次是Cu2+，0.5 mg/mL提取物，1.0 mg/mL提取物，1.5 mg/mL提取物，2.0 mg/ mL提取物，2.5 mg/mL提取物與DTPA絡合物掃描結果，可以看出峰值越來越小，說明隨著濃度的增大，提取物與銅離子的絡合能力越強，表明抑制由Cu2+誘導的LDL氧化的能力越強。

2.4 提取物總抗氧化能力

FRAP法是一種簡單易操作的測定總抗氧化能力的方法，用來測定在抗氧化劑存在下對Fe3+還原為Fe2+的影響［12，13］。從圖4可以看出，樣品濃度越大，抗氧化能力越強。

圖4 FRAP法測得椰子種皮油提取物總抗氧化能力Fig.4 The total antioxidant capacity of CTOE measured by FRAP assay

3 討論

諸多研究表明，LDL的氧化變性是動脈粥樣硬化初期病變的重要因素。活性氧和自由基是一種因失去一個電子而形成的不對稱、不穩定的原子和分子，具有很大的能量，以攻擊細胞組織中的脂質，蛋白質，糖類和DNA等物質，企圖奪取一個電子以求得重新平衡，這就造成了脂質和糖類的氧化、蛋白質的變性、酶的失活、DNA結構的切斷或堿基變化等種種改變，從而導致細胞膜、遺傳因子等的損傷，因而引發種種疾病、癌變、老化等［14］。植物多酚能夠有效清除人體內過剩的自由基，如能夠阻止活性氧引起的生物大分子(如脂類、蛋白質等)的氧化損傷，且對由自由基誘發的生物大分子損傷起到保護作用［9］。

據文獻［4］報道，用帶有種皮的椰肉提取的椰子油中的多酚類物質及其他活性物質要比只用白椰肉提取的椰子油中含量高出許多，如沒食子酸，兒茶素，表兒茶素含量比較高等，說明椰子種皮中也含有豐富的多酚類物質。但是對于只用椰子種皮提取的油脂的研究，目前還沒未見有報道。本文研究結果表明椰子種皮油提取物具有較好的抗氧化活性和對Cu2+誘導的LDL氧化的抑制作用。保護作用的機制可能是提取物中含有的多酚類化合物清除氧自由基、阻斷過氧化鏈式反應、螯合游離的Cu2+［10］、生成絡合物、減少金屬離子催化的LDL的氧化等。但這些假設還需要鑒定提取物的成分以后才能確定。椰子種皮油提取物具有較強的抗氧化活性，可以提高椰子種皮油的利用價值，提高椰子加工副產物的利用率。

參考文獻

1 Esterbauer H，et al.The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL.Free Radic Biol Med，1992，13:341-390.

2 Witztum JL.The oxidation hypothesis of atherosclerosis.Lancet，1994，94:1577-1584.

3 Stocker R.Dietary and pharmacological antioxidants in atherosclerosis.Curr Opin Lipidol，1999，10:589-597.

4 Seneviratne KN，HapuarachchI CD.Comparison of the phenolic-dependent antioxidant properties of coconut oil extracted under cold and hot conditions.Food Chem，2009，114，1444-1449.

5 Seneviratne KN，et al.Variation of phenolic content in coconut oil extracted by two con.ventional methods.Int J Food Sci Technol，2008，43，597-602.

6 John K.Lodge，Maret G.Traber，et al.Thiol Chelation of Cu2+By Dihydrolipoic acid Prevents Human Low Density Lipoprotein Peroxidation.Free Radic Biol Med，1998，25: 287-297.

7 Chakraborty S，Singh OP，Dasgupta A，et al.Correlation between lipid peroxidation-induced TBARS level and disease severity in obsessive-compulsive disorder.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2009，33:363-366.

8 LingY(李鶯)，Ji BP(籍保平)，Zhou F(周峰)，et al.Antioxidant properties of oat extracts on free radicals and their inhibitory effects on low density lipid oxdation.Food Sci(食品科學)，2008，29:75-78.

9 Peter M.Abuja，Michael Murkovic，et al.Antioxidant and prooxidant activities of elderberry(Sambucus nigra)extract in low-density lipoprotein oxidation.Agric Food Chem，1998，46，4091-4096.

10 Lin YJ(林櫻姬)，Zhao P(趙萍)，Wang Y(王雅)，et al.Research progress on extraction and biological activity of polyphenols from plants.Shanxi Agric Sci(陜西農業科學).2009，(6):105-107.

11 Berrougui H，Cloutier M，Isabelle M，et al.Phenolic-extract from argan oil(Argania spinosaL.)inhibits human lowdensity lipoprotein(LDL)oxidation and enhances cholesterol efflux from human THP-1 macrophages.Atherosclerosis，2006，184:389-396.

13 Reddy PE，Manohar SM，Reddy SV，et al.Ferric reducing ability of plasma and lipid peroxidation in hemodialysis patients:Intradialytic changes.Int J Nephrol Urol，2010，2:414-421.

14 Zhao KM(趙克默)，Yang YJ(楊毅軍)，Cao DJ(曹道俊).Oxygen Free Radical and Clinical(氧自由基與臨床).Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press，2000.

15 Stocker R，Keaney Jr JF.Role of oxidative modifications in atherosclerosis.Physiol Rev，2004，84:1381-1478.

Inhibition of Coconut Testa Oil Extracts on Human Low-density Lipoprotein Oxidation

ZHAO Xiao-li1，2，CHEN Wei-jun1*，ZHAO Song-lin1，ZHANG Chun-mei1，WANG Fang2

1Coconut Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Wenchang 571339，China;2College of Food，Hainan University，Haikou 570228，China

The inhibition activity of coconut testa oil extracts on human low density lipoprotein(LDL)was investigated by comparing with Trolox.Assays of copper-mediated LDL oxidation，thiobarbituric acid-reactive substances(TBARS) formation，total antioxidant capacity，total phenolic content and Cu2+binding studies were carried out in this paper.The results showed that the extracts of coconut testa oil had the evident inhibition effect on low density lipoprotein oxidation.The total phenolic content was 68.6 mg/100 g.And 100 μL extract at 0.5 mg/mL could increase the lag time to 41 min，but evidently decrease the value of TBARS.

coconut testa oil extracts;LDL;TBARS;lipid peroxidation;Cu2+binding

TS222+.1

A

1001-6880(2012)05-0668-04

2011-06-08 接受日期:2011-11-03

公益性行業(農業)科研專項經費項目(200903026-3);海南省社會發展科技專項(2010SF006)

*通訊作者 E-mail:xachenweijun@yahoo.com.cn