線粒體ND4基因12026A→G變異與2型糖尿病的相關(guān)性研究

鄭壽煥 楊秀麗 李蘭 車惠英 王敬銜 姚慶春

糖尿病是最常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，是一種多基因疾病，遺傳因素在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，近年來學(xué)者們應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，研究糖尿病的候選基因，探討其遺傳學(xué)發(fā)病機制。文獻(xiàn)報道，在不同種族、不同地區(qū)的2型糖尿病患者中線粒體基因的突變率不同，線粒體基因突變與糖尿病關(guān)系的觀點不一［1，2］。本研究對延邊地區(qū)328例2型糖尿病患者(其中80例有家族史)及108例正常對照組線粒體DNA ND4基因進(jìn)行突變分析，旨在探討延邊地區(qū)T2DM患者線粒體DNA基因變異情況及線粒體基因變異與2型糖尿病的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1 研究對象 隨機選取在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢者108例:男65例、女43例，平均年齡(30.4±9.7歲)作為正常對照組，臨床和實驗室檢查均正常，排除肝、腎、內(nèi)分泌和心腦血管疾病，近3個月無服用任何藥物史;選取2009年12月至2012年2月在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病患者328例:男194例、女134例，平均年齡(35.1±6.9)歲。糖尿病診斷依據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除妊娠、急性感染、腫瘤、外傷、心、肝疾病及服用羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、噻唑烷二酮類藥物者。根據(jù)線粒體DNA基因變異情況將T2DM患者分為基因變異組和基因非變異組。所有受檢對象均為延邊地區(qū)無血緣關(guān)系個體，均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 ①基因組DNA提取:采用Promega公司生產(chǎn)的Wizard@Genomic DNA Purification Kit提取DNA。取被受檢者肘靜脈血2 ml到加有EDTA抗凝劑的真空采血管中，并立刻顛倒混勻，置于離心機中3000轉(zhuǎn)離心10 min，取300 μl白細(xì)胞加入到1．5 m l離心管中，按照細(xì)胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白質(zhì)、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的過程分別加入試劑，進(jìn)行DNA的提取。所得DNA經(jīng)紫外分光光度計定量，并置于-70℃保存?zhèn)溆谩＂赑CR擴增 m tDNA ND4區(qū)域基因片段，根據(jù)GenBank中所報告的序列參考文獻(xiàn)報道［3］，采用北京華美公司合成的上游引物上游引物:5′-TTT ACCACAACACAATGGGG-3′，下 游 引 物 5′-AAGGGGTCGTAAGCCTCTGT-3′;PCR 擴增體系(50 μl):包括 5×Green GO Taq Buffer 10 μl，MgcL22 μl，dNTP 1 μl，上游 1 μl，下游1 μl，Taq DNA 聚合酶，0．25 μl，滅菌注射用水29．75 μl，DNA 5 μl;PCR循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產(chǎn)物。③PCR產(chǎn)物的限制性酶切:20μl酶切體系包括PCR產(chǎn)物5μl，HincII內(nèi)切酶 0．5 μl，滅菌注射用水14．5 μl，置于 37℃水浴箱中水浴 3 h。5%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。④PCR擴增產(chǎn)物直接測序:PCR產(chǎn)物用凝膠電泳DNA回收試劑盒純化回收DNA片段后，送北京奧萊博生物技術(shù)有限責(zé)任公司，完成PCR擴增產(chǎn)物測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 17．0軟件包進(jìn)行分析。主要檢測指標(biāo)均進(jìn)行資料分布類型檢驗和方差齊性檢驗，正態(tài)分布的各統(tǒng)計指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，行t檢驗，率的比較行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 線粒體DNA ND4(nt11990-12199)區(qū)域經(jīng)PCR擴增后得到產(chǎn)物片段長度為209bp(見圖1)，限制性內(nèi)切酶HincⅡ酶切識別位點為GTY↓RAC(R=A或G，Y=G或T)，線粒體DNA 12026位點發(fā)生變異時將被分割成171bp和38bp兩個片段。(見圖2)。直接測序發(fā)現(xiàn)線粒體基因12026位點發(fā)生A→G變異(見圖3)。

2.2 在328例2型糖尿病患者中共檢出線粒體DNA 12026 A→G變異20例，其變異率為6．1%;在108例對照組中檢出線粒體DNA 12026 A→G變異1例，其變異率為0．9%(χ2=4．740，P ＜0．05)(見表1)。

2.3 2型糖尿病患者中線粒體基因12026A→G變異組與非變異組在空腹血糖，糖化血紅蛋白及肌酐比較有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0．05;在病程，體重指數(shù)，餐后2 h血糖等臨床資料比較無統(tǒng)計學(xué)差異，P ＞0．05(見表2)。

圖1 線粒體基因ND4(12026)2%瓊脂糖凝膠泳結(jié)果

圖2 HincⅡ酶切線粒體基因ND4(12026)5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖3 線粒體基因ND4 12026(A→G)變異反向測序圖

表1 線粒體ND4基因12026在病例組與對照組中的變異情況(例，%)

表2 2型糖尿病患者線粒體基因12026A→G變異及非變異的臨床生化指標(biāo)(±s)

表2 2型糖尿病患者線粒體基因12026A→G變異及非變異的臨床生化指標(biāo)(±s)

組別 例數(shù)(n)病程(years)BMI(kg/m2)FBG(mmol/L)PBG(mmol/L)HbA1c(%)Cr(μmol/L)9 8．38 ±0．74 92．75 ±8．81非變異 308 8．83 ±5．78 23．84 ±2．40 5．92 ±1．68 10．59 ±1．95 7．36 ±0．49 74．42 ±14．94 P 值 0．75 0．64 0．02﹡ 0．11 0．001﹡ 0．02變異 20 8．08 ±5．48 24．36 ±2．87 7．93 ±2．24 12．28 ±2．9﹡

3 討論

線粒體是真核生物中的細(xì)胞器，是細(xì)胞的供能場所，它主要通過氧化磷酸化為生物組織和細(xì)胞提供進(jìn)行生命活動所需的的能量和ATP。mtDNA是獨立于細(xì)胞和染色體以外的由16569個堿基對組成的環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯功能。每個卵細(xì)胞含有幾十萬個線粒體DNA，而精子的線粒體集中于尾部，受精時，僅精子頭部與卵子細(xì)胞融合成成合子，受精卵中的線粒體遺傳物質(zhì)均來自于母系，因此mtDNA的遺傳是母系遺傳而不是孟德爾遺傳特點［4］。

線粒體DNA 12026A→G的突變使得由其編碼的異亮氨酸被纈氨酸取代，該變異改變了NADH脫氫酶(復(fù)合體工)亞單位4的二級結(jié)構(gòu)，從而影響呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ-Ⅳ酶活性，影響線粒體氧化磷酸化的能力，ATP生成減少，降低胰島細(xì)胞分泌胰島素的能力，使胰島素作用缺陷，從而誘發(fā)糖尿?。?］。

文獻(xiàn)報道，日本2型糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)該位點變異，變異率為3.95%，正常人群中該位點的變異率為0.87%，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義［6］。國內(nèi)研究認(rèn)為該位點變異只是人群中的一種基因多態(tài)性并且該位點的變異與自身免疫功能有關(guān)［7，8］。本次實驗中在328例2型糖尿病患者中共檢出線粒體DNA 12026 A→G變異20例(其中16例變異個體合并糖尿病腎損傷)，其變異率為6.1%;在108例對照組中檢出線粒體DNA 12026 A→G變異1例，其變異率為0.9%(χ2=4.74，P＜0.05)，研究結(jié)果提示，線粒體DNA 12026 A→G變異與延邊地區(qū)2型糖尿病的發(fā)生有一定的相關(guān)性。

綜上所述我們認(rèn)為線粒體DNA 12026 A→G變異與延邊地區(qū)2型糖尿病的發(fā)生有一定的相關(guān)性，可能加重糖尿病的病情;線粒體DNA 12026 A→G變異與FBG，HbA1c和Cr有關(guān)。但線粒體DNA 12026 A→G變異與糖尿病腎損傷的具體關(guān)系及影響機制仍需進(jìn)一步的研究。

［1］ Liu SM，Zhou X，Zheng F，et al.Novelmutations found in mito chondrial diabetes in Chinese Han population.Diabetes Res Clin-Pract，2007，76(3):425-435．

［2］ 熊燏，周新，錢士勻，等.線粒體基因5個位點與2型糖尿病早發(fā)的關(guān)聯(lián)研究.中國糖尿病雜志，2008，16(10):589-591．

［3］ 王遂軍，吳松華，鄭泰山，等.家族性糖尿病人群中線粒體ND4基因12026A→G突變的分析研究.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2006，23(6):652-654．

［4］ Guo Y，CaiQ，Samuels DC，et al.The use of next generation sequencing technology to study the effect of radiation therapy onmitochondrial DNA mutation.Mutat Res，2012，［Epub ahead of print］．

［5］ Liu SM，et al.Novelmutations found in mitochondrial diabetes in Chinese Han population.Diabetes Res Clin Pract，2007，76(3):425-435．

［6］ Tawata M，Ohtaka M，1wase E，etal.New mitochondrlal DNA homoplasmie mutations associated with Japanese patients with type 2 diabetes.Diabetes，1998，47(2):276-277．

［7］ Wang SJ，Wu SH，Zheng TS，et al.Prevalence and clinical characteristics of the A to G variantatposition 12026 of themitochondrial ND4 gene in familial diabetes mellitus in Chinese population.Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2006，23(6):652-654．

［8］ 李明珍，于德明，劉德敏，等.攜帶線粒體DNA ND4區(qū)12026A→G點突變的糖尿病家系臨床特點.中國糖尿病雜志，2008，16(5):260-261．