葉酸聯合成體神經干細胞治療創傷性腦損傷大鼠的實驗

刁 波，劉 琴，王麗萍，張 宜

(中國人民解放軍廣州軍區武漢總醫院醫學實驗科，武漢 430070)

葉酸聯合成體神經干細胞治療創傷性腦損傷大鼠的實驗

刁 波，劉 琴，王麗萍，張 宜

(中國人民解放軍廣州軍區武漢總醫院醫學實驗科，武漢 430070)

目的 觀察葉酸聯合成體神經干細胞對創傷性腦損傷大鼠的治療作用，探討其可能作用機制。方法 120只Wistar大鼠隨機分為6組，正常組，模型組，假手術組，葉酸注射組，成體神經干細胞移植組，成體神經干細胞移植+葉酸注射組。倒置顯微鏡下觀察神經干細胞形態學變化;流式細胞儀檢測神經干細胞表面標記物CD105、CD45、CD44、CD29的表達;免疫熒光法檢測神經元特異性烯醇酶(NSE成熟神經元的特異性標志)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP膠質細胞的標記物)的表達;平衡木實驗檢測大鼠運動協調與整和能力;Morris水迷宮實驗測試各組大鼠的學習記憶能力;HE染色及Brdu免疫組化實驗觀察腦組織形態學變化;酶聯免疫吸附試驗檢測大鼠腦組中腦源性神經生長因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)的表達;蛋白質印跡法檢測腦組織中凋亡相關蛋白BCL－2、Bax、Caspase－3的表達。結果 分離所得細胞能在體外傳代培養，流式細胞儀檢測發現細胞陽性表達 CD44、CD29，陰性表達CD105、CD45，細胞經胎牛血清誘導分化后能形成NSE或GFAP陽性細胞。實驗表明，葉酸與成體神經干細胞干預創傷性腦損傷大鼠模型后能顯著改善其行為學變化，減輕腦組織的炎癥反應，恢復受損神經細胞，增加腦組織內BDNF、NGF的含量，上調BCL－2的表達，下調 Bax、Caspase－3的表達。結論 葉酸聯合成體神經干細胞干預創傷性腦損傷大鼠能顯著改善中樞神經功能，對維持神經元微環境穩態具有重要的作用。

葉酸;成體神經干細胞;創傷性腦損傷

創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是由創傷引起的腦組織損害，它是45歲以下人群死亡的主要原因。文獻報道［1］，在美國每年有200～800萬人遭受TBI，約400～500萬人因嚴重TBI而需住院治療，TBI的前3位原因是交通事故、槍傷和墜落，英國也是以交通事故為最常見病因［2］。成體神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是一類具有多向分化潛能的細胞，能分化成神經系統的細胞即神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，而且具有自我更新和維持的能力［3－4］。主要存在海馬齒狀回的顆粒下層(sub－granular zone，SGZ)、側腦室的室管膜下區(subvent ricular zone，SVZ)等部位［5－6］。葉酸(folate，p teroylglutamate或維生素B9)是保持身體健康、生長及發育所必需的水溶性B族維生素，是一組由數目不同的谷氨酸殘體(glutamic－acid residues)的喋啶環結合而成的相關化學結構物的總稱。葉酸不但與造血系統有密切的關系，也參與了神經系統生長發育。有學者研究表明，葉酸對NSCs的增殖、分化亦具有重要的影響［7－8］，但作用機制尚不明確。課題組通過前期工作發現葉酸能顯著降低缺氧條件下神經細胞炎性蛋白的表達及 Ca2+超載的發生，明顯上調Notch1mRNA及Notch1蛋白的表達，對神經細胞具有顯著的保護作用。因此，本實驗通過葉酸聯合成體神經干細胞干預創傷性腦損傷大鼠具有理論和技術上的可行性，為臨床采用葉酸合并成體NSC治療中樞神經系統疾病提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料Wistar大鼠由湖北省醫學實驗動物中心提供，動物生產合格證號［SCXK(鄂)2008－0004］，動物使用合格證號［SYXK(鄂)2008－0007］。注射用亞葉酸鈣注射液購置廣東嶺南制藥有限公司;DMEM/F12培養基、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、青鏈雙抗均購自美國Sigma公司;N2、B27、胎牛血清(FCS)購自美國Gibco公司;NSE、GFAP抗體購置美國 Santa公司，山羊抗兔Cy3熒光二抗購置美國KPL公司;CD105、CD45、CD44、CD29熒光抗體購置 BD公司;BDNF、NGF ELASA 試劑盒購置R＆D公司;Bcl－2、Bax、Caspase－3抗體購置BioLegend公司。

1.2 成體NSC的分離、原代培養及傳代 取6周齡Wistar大鼠，戊巴比妥鈉過量麻醉致死，斷頭，無菌條件下取出腦組織，在Hanks平衡液內分離SGZ和SVZ腦組織，收集于含 2mL神經干細胞培養液(DMEM/F12 培養液添加 1%N2、2%B27、20μg/L EGF和20μg/L bFGF)的離心管。用1mL移液器反復吹打30次將大部分組織分離成細胞懸液，用75 μm濾網過濾除去未分離組織及細胞碎片。加培養液至細胞懸液達10mL并混勻，吸取10 μL細胞懸液與等量錐蟲藍液混勻后用血細胞計數板計數細胞總量。根據細胞計數，將細胞懸液調節為 1×105個/mL后，置于 CO2培養箱內培養。每3天半量換液，第2周吹打分離傳代。待第2代細胞形成神經球后，用于后續實驗。

1.3 成體 NSC的鑒定［9］取擴增一代的 NSC，去掉培養液，PBS洗2遍，用1∶1的0.25%的胰蛋白酶和0.2%EDTA混合液消化，用含20%BSA的PBS洗滌后制成濃度為1.0×106/mL的單細胞懸液，每個Eppendof管加500 μL細胞懸液，共3個檢測管。1號陰性對照(不加抗體)，2號管為同型對照(分別加入 5 μL 抗鼠的 IgG1－FITC、APC、PE、PerCP/Cy5.5)，3號管為檢測管(分別加入 5 μL抗人的CD105－PerCP/Cy5.5、CD45－APC、CD44－FITC、CD29－PE)。室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測。

1.4 成體NSC的誘導分化［10］待第2代細胞形成神經球后，培養基中加入10%的FCS誘導成體NSC分化，在誘導的第7天，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗3次，用 5%BSA的封閉液(含0.2%Trition X－100)室溫封閉l h后，加入鼠來源的 GFAP及NSE抗體(1:100)，37℃作用2 h，PBS漂洗3次，每次5 min，加入 TRITC標記的抗小鼠二抗1200)，避光37℃反應1 h，PBS漂洗3次，每次5 min，接著用 DAPI染色，室溫5 min，PBS漂洗，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.5 實驗動物分組及處理120只SPF級8周齡雄性SD大鼠(200±10 g)，隨機分為6組，正常組、模型組、假手術組、干細胞移植組、注射葉酸組(0.5mg/d·kg)、干細胞移植+注射葉酸組。分別于神經干細胞移植后第1天、14天、28天用于后續實驗。

1.6 腦外傷動物模型的制作用Feeney法按自由落體致傷原理，自制撞擊裝置。撞桿頭端直徑 4.5mm，高2.5mm，保持90°垂直，于冠狀縫后1.5mm，中線右旁2.5mm處鉆一直徑為5mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完整 ，將撞桿頭端置骨窗處，擊錘 (重40 g)沿外周導管從20cm高處自由落下沖擊撞桿導致腦部損傷，術后連續肌肉注射青霉素10萬U 1周。假手術組大鼠僅切開顱部皮膚，縫合。

1.7 成體NSC腦內移植 動物模型制備72 h后，將大鼠麻醉后固定于腦立體定向儀上，經過無菌操作，用滅菌的玻璃微量進樣器吸取 10ul成體 NSC細胞懸液(1×105個NSC)，在前囟后3mm和側1.1mm處分別在大腦皮層下2mm和4mm移植細胞，每點移植 5 uL細胞懸液，注射速度 1μL/min，注畢留針20 min并以0.5mm/min速度緩慢退針。退針后常規縫合，術后連續肌肉注射青霉素10萬μL周。

1.8 平衡木實驗 于神經干細胞移植后1 d，14 d，28 d進行。170cm長，2cm寬的方木棒，平放在距地面70cm處，讓大鼠在平衡木上走。評分標準:0分:穩健地保持平衡;1分:完全抓住平衡木的一端;2分:抱住平衡木，一個肢體滑落;3分:抱住平衡木，兩個肢體滑落，或繞木旋轉≥60 s;4分:試圖保持平衡，但在40～60 s之間滑落;5分:試圖保持平衡，但在20～40 s之間滑落;6分:試圖保持平衡，但在20 s之內滑落。平衡木試驗是直接反映大鼠運動協調與整和能力的指標。

1.9 Morris水迷宮實驗于神經干細胞移植后14 d，28 d進行。用 Morris水迷宮測試其學習與記憶成績。前4 d為訓練時間，第5天為測試時間。訓練每天上午進行，訓練5次，每次間隔15 min，每次將大鼠面向池壁分別從4個象限的4個入水點入水，記錄其在60 s內尋找平臺的時間，即逃避潛伏期(escape latency)。如果達60 s仍未找到平臺，則引導其到達平臺，停留 30 s，本次成績計為 60 s，然后進行下次訓練。測試時取消平臺，同法觀察各組大鼠尋找隱蔽平臺所需的時間(潛伏期)。

1.10 HE染色及Brdu免疫組化 于神經干細胞移植后1 d、14 d、28 d取腦組織行 HE染色及免疫組化染色。經10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，經升主動脈快速灌注肝素化0.9% 氯化鈉注射液150mL，繼之快速灌注冰冷的4%多聚甲醛液200mL，再用300mL在2 h內慢速灌注，取腦組織浸入4%多聚甲醛內4℃固定48 h，修成厚4mm塊，常規酒精脫水，石蠟包埋，作5μm冠狀切片，行 HE及 BrdU免疫組織化學染色。

1.11 免疫印跡法檢測腦組織中凋亡相關基因BCL－2、Bax、Caspase－3 的表達 將動物快速斷頭取腦，分離全腦組織置于4℃預冷的全細胞裂解液0.6 ml冰水浴中勻漿，12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液。以考馬斯亮藍G250結合法蛋白定量，－80℃保存備用。取15 μg蛋白樣本加入2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸 5 min，6 000 r/min離心 3 min，取上清液上樣，電泳后將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜，轉膜后室溫下封閉2 h，將PVDF膜放入雜交袋，分別加入一抗(BCL－2、Bax、Caspase－3，1:800稀釋)4℃過夜，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1:1500稀釋)和預染蛋白Marker，室溫下振蕩孵育1 h，濾膜漂洗后加入顯影液顯色，放入X－光片夾中曝光。結果經計算機掃描后，自動圖像分析系統進行半定量分析，在同一條件下測定目標條帶整合光密度值，計算出各組樣品目標條帶與內參(βactin)的整合光密度比值。

1.12 ELISA法檢測腦內BDNF和 NGF的含量 制備10%腦組織勻漿液，10000 rpm離心10 min，取上清測蛋白濃度，取50 uL待測樣品，采用 R＆D公司提供的BDNF和 NGF試劑盒，操作步驟嚴格遵循試劑盒所提供說明書的要求。酶標儀405 nm處測出各組A值，計算腦組中BDNF和 NGF的含量。

1.13 統計學處理與分析 通過SPSS13.0統計軟件用單因素方差分析及t檢驗，實驗數據以均數±標準差(±s)表示

2 結果(封底圖1、2、4)

2.1 成體NSC的形態學變化 倒置顯微鏡下，可見剛培養的細胞散在且胞體較小，呈圓形，折光性較好(圖1a)。3 d后逐漸形成由數個細胞組成的細胞球(圖1b)。培養至5 d存活的細胞已形成由數十個到數百個細胞組成的較大的細胞球(圖1c)。傳代后，在培養基中既可見到單細胞，也可見到呈不規則形狀的小細胞團。傳代后部分單個細胞則出現分裂相，逐漸形成由較多細胞組成的細胞球。NSC經10%FCS誘導分化后，1 d胞體出現突起，折光性較好(圖2a)。3 d鏡下觀察出現典型的神經細胞(圖2b)。5 d神經細胞胞體飽滿，周圍有光暈，軸、樹突細長明顯，交織成網絡(圖2c)。

2.2 成體NSC的鑒定流式細胞儀檢測體外傳代培養第 1代的 NSCs表面標記 CD105、CD45、CD44、CD29的表達，結果顯示，NSCs表面分子 CD44、CD29呈陽性表達，不表達 CD105，CD45，提示分離培養的細胞可能具有間充質干細胞的性質(圖3)。

圖3 流式細胞儀鑒定成體NSCs實驗結果表明原代培養所獲取的成體NSCs呈CD44、CD29雙陽性表達，表達率為99.38%，但不表達CD105、CD45。實驗結果提示:所獲取的細胞具有明顯間充質干細胞特征，符合實驗要求Fig.3 The result ofFlow detection for adult NSCs The experimental results show that the primary culture of adult NSCs was acquired by CD44，CD29 positive expression，the rate was 99.38%，but did not express CD105，CD45.The experimental resultsindicate:the acquired cells with a distinct mesenchymal stem cell characteristics，in line with the experimental requirements

2.3 成體NSC的誘導分化 添加10%FCS培養基后，NSC很快貼壁分化，部分軸突相互交錯連接。24 h后細胞表面發生突起，并隨著時間推移突起逐漸增多變長，不同細胞的突起彼此相互交聯成網。7 d后進行免疫熒光染色顯示，培養的細胞呈 GFAP或NSE免疫反應陽性，提示培養的細胞分化為星形膠質細胞或神經元(圖4)。

2.4 平衡木實驗結果 由表1可見，模型組大鼠平衡木評分在實驗的各時間段均顯著高于正常組大鼠(P＜0.01)，實驗提示，模型組大鼠經創傷性損傷后其運動協調與整和能力明顯下降。治療第1d，3組平衡木評分比較差異無顯著性意義(P ＞0.05);治療第14天，28天，NSCs移植組、注射葉酸組、聯合治療組平衡木評分較模型組均有顯著改善(P ＜0.05)，與NSCs移植組及葉酸注射組比較，聯合治療組能明顯改善平衡木評分。

表1 各組大鼠平衡木評分(n=4)Tab.1 Balance beam score of rats in different groups(n=4)

2.5 Morris水迷宮實驗結果 水迷宮實驗結果提示，與正常組比較，模型組在尋找隱蔽平臺所需時間均有延長(P＜0.01)，實驗提示，模型組大鼠經創傷性損傷后其學習記憶能力顯著下降。治療14 d，28 d，各治療組大鼠的學習記憶功能均顯著改善，與NSCs移植組及葉酸注射組比較，聯合治療組能明顯改善大鼠的學習記憶功能(表2)。

2.6 HE染色及Brdu免疫組化實驗結果 治療后第1天，模型組及注射葉酸組創傷灶及周圍水腫區可見較多細胞核固縮、深染、細胞膜完整的神經細胞，即凋亡的神經細胞，也可見許多呈空泡狀的細胞，為液化壞死的神經細胞。NSCs移植組和聯合治療組均可見大量移植的細胞聚集、此時細胞形態結構正常，未見腫脹的細胞和炎性細胞。14 d時，聯合治療組大量細胞增生，主要為神經元，細胞結構正常，但病灶周邊也可見周圍水腫區，其范圍較其他損傷組明顯縮小;NSCs移植組和注射葉酸組病灶區周圍水腫減輕，凋亡細胞減少，神經元周圍可見有空隙，還可見胞核濃縮、深染，也有細胞增生，主要為膠質細胞。28 d時，聯合治療組神經元及膠質細胞形態結構正常，幾乎未見明顯腫脹的細胞和炎性細胞，基本接近正常組織。免疫組化實驗結果顯示，移植局部室管膜周圍聚集大量Brdu陽性細胞，提示移植的 NSCs能夠存活。隨時間延長，移植的NSCs能沿一定路徑遷徙，最終大量分布在病灶部位。聯合治療組病灶部位亦聚集大量Brdu陽性細胞，并且具有向神經細胞及神經膠質細胞分化的趨勢，實驗提示，葉酸可能會促進 NSCs的增殖，同時增強其神經功能重建的作用，促進受損腦組織修復，改善TBI大鼠的運動功能。

表2 各組大鼠尋找隱蔽平臺所需的時間變化(s)(n=4)Tab.2 The change of time for finding hidden platform in different groups(n=4)

圖8 治療后第28天各組大鼠 BCL－2、Bax、Caspase－3及 Actin的免疫印跡實驗電泳圖Fig.8 The result of Immunoblotting experiments for BCL－2、Bax、Caspase－3 and Actin protein after treatment of 28 days

2.7 凋亡相關蛋白 BCL－2、Bax、Caspase－3 的表達免疫印跡實驗檢測了治療第28天時，各組大鼠腦組織中凋亡相關蛋白 BCL－2、Bax、Caspase－3 的表達。實驗結果顯示，各組均強表達內參 Actin蛋白，表明實驗結果可信。28 d 時，BCL－2、Bax、Caspase－3在正常組均有表達。與模型組比較，NSCs移植組及注射葉酸組 BCL－2表達具有上升趨勢，Bax及 Caspase－3表達具有下降趨勢，但無統計學差異(P ＞0.05)。聯合治療組 BCL－2表達明顯上升，Bax及 Caspase－3表達顯著下降(P＜0.05)(圖8－9)。

2.8 BDNF和 NGF在腦組織中的含量 ELASA實驗表明，模型組大鼠腦組中的BDNF和 NGF的含量明顯下降，營養神經能力下降。補充一定量的NSCs和腹腔注射葉酸后，BDNF和 NGF的含量明顯上升，對恢復神經生理功能具有顯著作用，聯合治療組二者含量上升明顯，顯著高于單一治療組(表3、表4)。

圖9 各組大鼠 BCL－2、Bax、Caspase－3的灰度比值 實驗結果顯示，正常組、模型組、假手術組、葉酸組、干細胞組及聯合治療組的 BCL－2灰度比值分別為 1.138、0.0892、0.665、0.525、0.685、0.883;Bax灰 度比值分別為 0.644、1.417、0.711、1.003、0.945、0.887;Caspase－3 灰 度 比 值 分 別 為0.232、0.735、0.445、0.559、0.401、0.322Fig.9 The intensity ratio of BCL－2，Bax，Caspase－3 in each group The experimental results show that，the normal group，model group，sham operation group，folic acid group，stem cell group and combined treatment group BCL－2intensity ratios were 1.138，0.0892，0.665，0.525，0.685，0.883;Bax grayness ratio were 0.644，1.417，0.711，1.003，0.945，0.887;Caspase－3 intensity ratios were 0.232，0.735，0.445，0.559，0.401，0.322

表3 各組大鼠腦組織中BDNF的含量變化(ng/gpr)(n=4)Tab.3 The change of BDNF content in brain tissue in different groups(ng/gpr)(n=4)

表4 各組大鼠腦組織中NGF的含量變化(ng/gpr)(n=4)Tab.4 The change of NGF content in brain tissue in different groups(ng/gpr)(n=4)

3 討論

腦外傷后由于血腦屏障破壞、神經遞質代謝異常、炎性介質積聚和腦微循環障礙導致腦功能缺失［11－12］。既往治療多側重于從一個或多個方面阻斷病變進展。胚胎發生學的研究提示任何神經細胞群的建立和功能維持均依賴于細胞內外多種特異性信號的相互作用，這些信號包括多種生長因子、營養因子和神經細胞之間的突觸聯系［13－14］。因此，改變腦局部微環境，增加神經細胞保護和修復因子成為治療研究方向。長期以來，人們一直認為中樞神經系統的神經細胞沒有再生能力，損傷后死亡的細胞不能像上皮組織那樣由再生的細胞替補。但是，近年來的研究發現，在中樞神經系統中也存在有干細胞，即成體 NSC。隨著研究的深入發現［15－16］，NSC 不光存在于胚胎期的腦組織中，在發育成熟的腦部(包括人腦)也有NSC存在，其主要在前腦的室管膜下區(subvent ricular zone，SVZ)和海馬齒狀回的顆粒細胞下層(subgranular zone，SGZ)。我們從成年大鼠腦組織中分離NSCs并在體外進行增殖培養，流式細胞儀鑒定發現其細胞表面分子CD29、CD44表達陽性，CD45、CD105表達陰性，提示原代培養的NSCs的具有間充質干細胞性質。用第2代成體 NSCs經10%FCS誘導，隨共培養時間延長，免疫熒光染色實驗證實所培養的細胞能分化為表達GFAP和 NSE的細胞，提示所培養細胞為NSCs。但在正常情況下，這些成體 NSC大部分處于休眠狀態，基本沒有分裂和分化現象。在損傷和局部環境變化時，成體NSC的生理活性則會上升。實驗結果提示，腦內單純移植成體 NSCs，行為學測試及神經營養因子檢測均表明移植14d后，大鼠的學習記憶能力明顯改進，神經細胞凋亡趨勢下降，神經營養因子分泌量顯著上升，促進神經環路重建，促進TBI大鼠神經生理功能的恢復。

葉酸在體內經葉酸還原酶的作用，還原為具有活性的四氫葉酸，它主要是作為一碳單位的傳遞體，參與嘌呤和嘧啶的合成及氨基酸之間的相互轉化［17－18］，體內葉酸缺乏則一碳單位傳遞受阻，核酸合成及氨基酸代謝受影響，而核酸及蛋白質合成正是細胞增殖、組織生長和機體發育的物質基礎，因此葉酸對調節神經發生、神經干細胞的增殖分化起到重要作用［19－20］。實驗結果表明治療 14 d后，葉酸能明顯改善TBI大鼠的平衡木評分和學習記憶能力，上調 BCL－2基因的表達，下調 Bax及 Caspase－3的表達，抑制神經細胞的凋亡，增強腦內 BDNF和NGF的表達，營養病灶周圍的神經細胞。統計學分析發現，單純移植成體NSCs的生物學作用有好于單純注射葉酸作用的趨勢，但無統計學差異(P ＞0.05)。實驗結果提示，葉酸可能是通過動員自身的成體NSCs增殖分化而達到改善其病情的作用。當移植成體 NSCs和注射葉酸聯合治療 TBI大鼠時。14 d后，各檢測指標均顯著好于模型組大鼠指標(P＜0.01)，大鼠行為學表現恢復明顯;與單純成體NSCs移植組和葉酸注射組比較，聯合治療組亦明顯優勢，實驗提示，成體NSCs與葉酸聯合使用具有良好的協同作用，體外補充的葉酸不僅能動員自身成體NSCs的增殖分化、同樣對移植的異源性成體NSCs增殖具有促進作用。因此，葉酸聯合成體NSCs移植對TBI大鼠有明顯的治療作用，對TBI患者的臨床康復具有重要的指導價值。

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Study on Folic Acid Combined with Adult Neural Stem Cells in the Treatment of Traumatic Brain Injury in Rats

DIAO Bo，LIU Qin，WANG Li－ping，ZHANG Yi
(Department of Medical Experiment，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command of Chinese PLA，Wuhan 430070，China)

Objective To explore the folic acid and adult neural stem cells’joint influencing mechanism on the rat with Traumatic Brain Injury，and to find out its possible mechanism.Methods Divide 120 rats to 6 groups randomly—normal group，mode group，sham operation group，folacin injection group，adult stem cells transplant group，and folacin injection plus adult stem cells transplant group.Observe the morphological change under the microscope，then，do flow cytometry test and detect the expression of the neural stem cells’facial notation—CD105、CD45、CD44、CD29.Examine the expression of neuron special enolase(NSE)and the expression of gelatinous fibre acidic protein(GFAP)withimmunofluorescence.Examine the rats’ability to motor－coordinate and conform with balance beam.Test each group’s learning and memorizing ability by conducting the Morris water maze experiment.Then，conduct the HE chromosome and Brdu immunohistochemistry experiment to detect morphological change of the brain tissue.After this，do the enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)to detect the expression of brain－derived neurotrophic factor(BDNF)and the expression of nerve growth factor.The last but not least，use western blotting to examine the expression of related dead protein in the brain tissue:BCL－2、Bax、Caspase－3.Results The separated cells can be vitro subcultured，by doing flow cytometry test，we find that positive cells express CD44 and CD29 while negative express CD105，CD45.Cells induced by fet al bovine serum can produce NSE or GFAP positive cells.Experiments suggest that traumatic brain injured rats can significantly improve their behavior after jointly influenced by the folic acid and adult neural stem cells.Besides，they can also reduce brain tissue inflammation，restore damaged nerve cells，increase brain tissue of BDNF and NGF＇s content，increase BCL 2 expression，and lower the expression of Bax，caspase－3.Conclusion The folic acid combined with adult neural stem cell intervention in traumatic brain injury in rats can significantly improve the central nervous system dysfunction，plays an important role to maintain the steady microenvironment in the neuron.

Folic acid;Adult neural stem cells;Traumatic brain injury

R322.8

A

1671－7856(2012)07－0048－08

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.013

2012－07－06

圖1 成體NSC的形態學變化
Fig.1 Morphological changes of adult NSC

圖2 成體NSC誘導后形態學變化
Fig.2 Morphological changes of adult NSC after induced

圖4 免疫熒光實驗表明，成體NSCs經10%胎牛血清誘導7d后，能分化為表達GFAP或NSE分子的神經膠質細胞或神經細胞，實驗提示所獲取的細胞為成體NSCs
Fig.4 Immunofluorescence experiments shoW that， as of NSCs With 10% fet al bovine serum7d after induction， can differentiate for the expression of the GFAP or NSE molecules in glial cells and nerve cells， the experiment suggested the acquired cells into NSCs

湖北省自然科學基金(2010CDZ030)。

刁波，男(1984－)，碩士，主管技師，研究方向:神經生物學。E－mail:dpitao@163.com。

張宜，E－mail:hbpizy@tom.com。