應(yīng)用遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析評價伊馬替尼和常規(guī)化療治療慢性粒細胞白血病的療效

李 莉，閆金松，康志杰，武克宇

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科，遼寧大連 116027)

應(yīng)用遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析評價伊馬替尼和常規(guī)化療治療慢性粒細胞白血病的療效

李 莉，閆金松，康志杰，武克宇

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科，遼寧大連 116027)

［目的］比較伊馬替尼和常規(guī)化療治療慢性粒細胞白血病的療效。［方法］收集20例慢性粒細胞白血病患者，其中11例應(yīng)用伊馬替尼治療，9例應(yīng)用常規(guī)化療。采用常規(guī)染色體顯帶技術(shù)和半定量RT-PCR技術(shù)對細胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)進行動態(tài)監(jiān)測，評價兩種不同治療方法的血液學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)緩解率。［結(jié)果］應(yīng)用伊馬替尼治療的患者均達血液學(xué)緩解，其中9例患者Ph染色體和bcr-abl融合基因消失，遺傳學(xué)緩解率為81%。應(yīng)用常規(guī)化療的患者均能達到血液學(xué)緩解，但無一例達遺傳學(xué)緩解。［結(jié)論］伊馬替尼治療慢性粒細胞白血病能達到部分或完全細胞遺傳學(xué)緩解及分子生物學(xué)水平的緩解，優(yōu)于常規(guī)化學(xué)藥物治療。

慢性粒細胞白血病;Ph染色體;bcr-abl融合基因;伊馬替尼

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起源于造血干細胞的血液系統(tǒng)惡性疾病，細胞遺傳學(xué)特征是具有Ph染色體，即t(9;22)(q34;q11)，其分子水平上形成bcr-abl mRNA。細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析對于慢性粒細胞白血病的發(fā)病機制、診斷分期、治療監(jiān)測以及預(yù)后判斷都具有很重要的價值。既往慢性粒細胞白血病患者多以干擾素聯(lián)合羥基脲控制白血病細胞數(shù)量，只能達到血液學(xué)緩解［1］，而新的靶向治療藥物甲磺酸伊馬替尼(簡稱伊馬替尼)是針對Ph染色體陽性(Ph+)白血病致病基因產(chǎn)物(P210bcr-abl或 P190bcr-abl)的分子靶向藥物，可使患者達到遺傳學(xué)甚至分子生物學(xué)緩解［2］。本文對大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院近4年分別應(yīng)用干擾素聯(lián)合羥基脲和應(yīng)用伊馬替尼治療的慢性粒細胞白血病患者的臨床效果進行了觀察。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2007年10月—2011年10月于對大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院和門診隨診的CML慢性期(CP)患者，男11例，女9例，年齡12～81歲，中位年齡45歲，患者初發(fā)時外周血白細胞數(shù)在22×109/L～410×109/L 間，中位數(shù)為 223.2×109/L，CML診斷分期標準參照張之南主編的《血液病診斷及療效標準》［3］。

1.2 治療方案

20例患者，初發(fā)時根據(jù)外周血白細胞數(shù)調(diào)整羥基脲用量，2～6 g/d，待白細胞降至20×109/L以下，9例患者應(yīng)用羥基脲聯(lián)合干擾素治療，應(yīng)用羥基脲0.5～1 g/d，干擾素300萬單位隔日1次肌注，維持白細胞至5～10×109/L，11例患者單用伊馬替尼400～600 mg/d治療，上述患者在初發(fā)時均檢查染色體核型和bcr-abl基因表達，每3個月復(fù)查染色體核型，直至Ph+染色體消失，每3個月復(fù)查bcrabl融合基因表達，連續(xù)觀察3年。

1.3 染色體核型分析

全部病例染色體標本取自患者骨髓。采用骨髓細胞直接培養(yǎng)法［4］，取新鮮肝素抗凝骨髓3 mL，在含20%小牛血清的1640培養(yǎng)基的標本瓶中按2×106/mL的細胞密度接種，37℃溫箱中持續(xù)培養(yǎng)24 h，加入終濃度0.05 μg/mL秋水仙堿，孵育1 h收獲細胞。常規(guī)G顯帶技術(shù)進行核型分析，全部病例分析細胞數(shù)均在20～30個。核型異常參照《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2005)》［5］的有關(guān)規(guī)定進行描述。

1.4 巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測bcr-abl融合基因

RNA提取采取新鮮骨髓或血液標本經(jīng)肝素或EDTA抗凝，用相對密度為1.077的淋巴細胞分層液分離單個核細胞。經(jīng)Trizol試劑(美國Invitrogen公司)、氯仿以及異丙醇等提取細胞總RNA。RNA為模板應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)反轉(zhuǎn)錄cDNA第1鏈，以cDNA為模板行巢式PCR，bcr-abl融合基因根據(jù)斷裂點位置不同，最常見拼接方式為Major型和minor型。Major型第1輪擴增引物為BCRA1:5’-GCTTCTCCCTGACATCCGTG -3’，ABLB:5’-CGAGCG GCTTCACTCAGACC -3’，第2輪擴增引物為 BCR-C1:5’-CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG-3’，ABL-D:5’-CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGC-3’。minor型第1輪擴增引物為 BCR-A2:5’-CGCATGTTCCGGG ACAAAAGC-3’，ABL-B:5’-CGAGCGGCTTCACTCAGACC-3’，第2輪擴增引物為BCR-C2:5’-AACAGT CCTTCGACAGCAGCAGTC -3’，ABL-D:5’-CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGC -3’。第2輪擴增均取5 μL第1輪的擴增產(chǎn)物為模板，兩輪 PCR 反應(yīng)條件均為:94℃，30 s，58℃，30 s，72℃，45 s，共 36 個循環(huán)，72℃ 5 min，4℃。同時設(shè)陽性及陰性對照。

1.5 療效標準

血液學(xué)療效:完全血液學(xué)緩解(CHR)標準:WBC＜10×109/L，BPC ＜450×109/L，外周血中無幼稚細胞;外周血中嗜堿粒細胞＜0.05;無髓外浸潤，需持續(xù)≥4周。

細胞遺傳學(xué)療效:完全細胞遺傳學(xué)緩解(CCyR)為骨髓中 Ph+細胞為0;主要細胞遺傳學(xué)緩解(MCyR)為Ph細胞≤35%。

分子學(xué)療效:完全分子學(xué)緩解(CMoR)為骨髓中實時定量RT-PCR方法檢測bcr-abl與abl比值為0;主要分子學(xué)緩解(MMoR)為治療后骨髓中bcr-abl與abl比值較治療前下降≥3個對數(shù)級。

2 結(jié) 果

2.1 血液學(xué)療效

20例患者在中位治療 0.8(0.2 ～2.3)個月時均獲CHR。羥基脲聯(lián)合干擾素組有1例22個月進入加速期，應(yīng)用化療未回到慢性期，2個月后轉(zhuǎn)為加速期，27個月時死亡。1例伊馬替尼組患者在治療22個月時喪失CHR(但未進入加速或急變期)，經(jīng)改用達沙替尼25個月時再次獲得CHR，已持續(xù)40個月。其余10例均在治療中，并持續(xù)CHR。

2.2 細胞遺傳學(xué)療效

9例羥基脲聯(lián)合干擾素組患者，7例染色體核型為46，t(9，22)(q34，q11)，2 例染色體核型為 46，XY。7例Ph+患者治療后每年復(fù)查染色體核型，均未達CyR。11例伊馬替尼組患者染色體核型均為46，t(9，22)(q34，q11)，有 2 例隨診 2 年未達 CyR，其余9例(81%)于中位6(2～33)個月時獲得CCyR，1例患者在治療第3個月時獲得CCyR，22個月時喪失CHR及CCyR，經(jīng)改用達沙替尼27個月時再次獲得CCyR至今。

2.3 分子學(xué)療效

羥基脲聯(lián)合干擾素組患者，有2例在染色體核型分析時無Ph+染色體，在bcr-abl擴增時為陰性，其他7例均為bcr-abl Major型陽性，治療2年后再次檢測，7例陽性者無一例轉(zhuǎn)陰。伊馬替尼組中初發(fā)時行融合基因檢測，bcr-abl Major型均為陽性，見圖1，與染色體核型分析符合率100%，2年分子學(xué)隨診評估結(jié)果為11例患者巢式RT-PCR檢測3例轉(zhuǎn)陰(27%)。其中1例于外院行實時定量PCR，證實拷貝數(shù)為0，達 CMoR，其余8例 bcr-abl融合基因未轉(zhuǎn)陰，但RT-PCR檢測顯示有5例患者擴增條帶明顯減弱，見圖2。其中3例于外院行實時定量PCR，證實bcr-abl/abl的比值明顯下降，下降幅度＞3個對數(shù)級，故可判定為MMoR，其中1例患者在伊馬替尼治療2.5個月、6個月、9.5個月時bcr-abl/abl的比值分別為 0.062%、0.082%、0.14%，達到MMoR，但在隨診過程中bcr-abl拷貝數(shù)有增高趨勢，現(xiàn)繼續(xù)隨診過程中。

圖1 1例慢性粒細胞白血病患者發(fā)病時的bcr-abl融合基因擴增結(jié)果Fig 1 Bcr-abl fusion gene expression in a onset CML patient

圖2 8例慢性粒細胞白血病患者治療前后的bcr-abl融合基因擴增結(jié)果Fig 2 Bcr-abl fusion gene expression in 8 CML patients before and after imatinib treatment

3 討論

慢性粒細胞白血病(CML)是一種累及造血干細胞的惡性克隆增殖性疾病［7］。在患者腫瘤細胞中可以檢測到t(9;22)(q34;q11)染色體易位和bcr-abl融合基因。臨床上，CML患者在平均3～5年的慢性期后進入加速或急變期，此時常伴有bcrabl基因在DNA水平擴增和mRNA及蛋白水平表達的上升。

既往治療慢性粒細胞白血病多采用羥基脲聯(lián)合干擾素控制白細胞數(shù)量，控制病情進展［8］，大宗病例的國際臨床試驗證實，伊馬替尼治療CML慢性期的有效性與安全性明顯優(yōu)于以往的藥物［9］。對早慢性期(1年以內(nèi))和IFN-α治療失敗的晚慢性期患者的遠期療效兩項研究結(jié)果均為CHR率96%;MCyR率分別為88%，73%;CcyR率分別為81%和63%，CcyR患者中 MMoR率和 CMoR率分別為75%、49%和36%、24%，預(yù)計42個月或48個月，PFS率和OS率分別為84%、80%和91%、86%［10］。本組11例慢性粒細胞白血病患者伊馬替尼治療后遺傳學(xué)緩解率(包括完全遺傳學(xué)緩解和主要遺傳學(xué)緩解)為90%。9例應(yīng)用羥基脲聯(lián)合干擾素控制白細胞數(shù)量的患者，7例Ph染色體陽性，無一達遺傳學(xué)緩解，證明伊馬替尼治療遺傳學(xué)療效優(yōu)于傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療。

雖然伊馬替尼已被大量研究證實是一種安全、能有效治療慢性粒細胞白血病的藥物，但部分患者已在用藥過程中出現(xiàn)耐藥，從而發(fā)生疾病的進展，目前研究者們提出解決伊馬替尼耐藥的策略主要有［11］:增加伊馬替尼劑量、使用其他更強烈可抑制bcr-abl的藥物如第二代酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼和尼洛替尼［12］，異基因干細胞移植［13］等。本組中1例伊馬替尼組患者在治療22個月時喪失CHR(但未進入加速或急變期)，經(jīng)伊馬替尼劑量增高至600 mg/d，無效，改用達沙替尼后2個月達血液學(xué)緩解，25個月時再次獲得CHR，已持續(xù)40個月，提示二代酪氨酸激酶抑制劑可有效逆轉(zhuǎn)伊馬替尼耐藥。

探討應(yīng)用伊馬替尼的慢性粒細胞白血病患者在獲得CCyR后停用藥物治療的可能性的臨床試驗正在進行中［14］，在應(yīng)用伊馬替尼3年后開始停止服藥，停藥12個月時，仍然CyR的占41%，復(fù)發(fā)患者再次應(yīng)用伊馬替尼，38%的患者bcr-abl水平下降，61.9%的患者取得持久PCR陰性，顯示停藥后部分患者仍可維持一段時間的緩解，提高了生活質(zhì)量，復(fù)發(fā)患者再次應(yīng)用依然有效。

伊馬替尼治療慢性粒細胞白血病的臨床療效肯定，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)化療，第二代藥物仍在不斷改進中。因此，酪氨酸激酶抑制劑類藥物有望成為根治慢性粒細胞白血病的特效藥物，藥物的耐藥、劑量調(diào)整及長期用藥的停藥指證探討可有望延長緩解時間，提高生存質(zhì)量，為挽救更多慢性粒細胞白血病患者的生命帶來希望。

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［1］O’Brien SG，Guilhot F，Larson RA，et al.Imatinib compared with interferon and low dose cytarabine for newly diagnosed chronic - phase chronic myeloid leukemia［J］.N Engl J Med，2003，348(13):994 -1004.

［2］Buchdunger E，Matter A，Dmker BJ.Bcr- Abl inhibition as a modality of CML thempeutics［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1551(1):M11 - M18.

［3］張之南，沈悌.血液病診斷及療效標準［M］.第3版.北京:科學(xué)技術(shù)出版社，2007.134.

［4］陳蘇寧，薛永權(quán)，吳亞芳，等.急性髓系白血病患者染色體異常核型檢出方法的改進［J］.中華血液學(xué)雜志，2004，25(3):181 -183.

［5］Shaffer LG，Tommerup N.SCN:An International System for Human Cytogenetic Nomenclature［S］.Karger S Basel，2005.

［6］王慧萍，李國霞，喬振華，等.聯(lián)合應(yīng)用細胞遺傳學(xué)，巢式RT-PCR和FISH技術(shù)檢測慢性髓系白血病治療過程中的腫瘤負荷［J］.中國實驗血液學(xué)雜志，2007，15(2):237-241.

［7］Gallipoli P，Abraham SA，Holyoake TL.Hurdles toward a cure for CML:the CML stem cell［J］.Hematol Oncol Clin North Am，2011，259(5):51 -66.

［8］Hochhaus A，Druker B，Sawyers C，et al.Favorable long -term follow up results over 6 years for response，survival，and safety with imatinib mesylate therapy in chronic-phase chronic myeloid leukemia after failure of interferon-alpha treatment［J］.Blood，2008，111(3):1039 - 1043.

［9］Druker BJ，0’Brien SG，Guilhot F，et al.Five - year followup of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia［J］.N Engl J Med，2006，355(7):2408 -2417.

［10］Martin Henkes，Heiko van der Kuip，Walter E Aulitzky.Therapeutic options for chronic myeloid leukemia:focus on imatinib(Glivec?，GleevecTM)［J］.Ther Clin Risk Manag，2008，4(1):163-187.

［11］Quint s- Cardama A，Kantarjian HM，Coaes JE.Mechanisms of primary and secondary resistance to imatinib in chronic myeloid leukemia［J］.Cancer Control，2009，16(2):122-131.

［12］le Coutre P，Ottmann OG，Giles F，et al.Nilotinib(formerly AMNl07)，a highly selective BCR -ABL tyrosine kinase inhibitor，is active in patients with imatinib—resistant or intolerant accelerated-phase chronic myelogenous leukemia［J］.Blood，2008，111(4):1834 -1839.

［13］Fernandez HF，Kharfan-Dabaja MA.Tyrosine Kinase lnhibitors and Allogeneic Hematopoietic Cell Tramplantation for Chronic Myeloid Leukemia:Targeting Both Therapeutic Medalities［J］.Cancer Control，2009，16(2):153-158.

［14］Mahon FX，Réa D，Guilhot J，et al.Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years:theprospective，multicentreStop Imatinib(STIM)trial［J］.Lancet Oncol，2010，11(11):1029 -1035.

Efficiency evaluation of imatinib and traditional chemical therapy in patients with chronic myeloid leukemia by analysis of cytogenetics and molecular genetics

LI Li，YAN Jin - song，KANG Zhi- jie，WU Ke - yu
(Department of Hematology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China)

Abstract:［Objective］To compare the efficiency of imatinib mesylate(imatinib)and traditional chemical therapy in patients with chronic myeloid leukemia(CML)in chronic phase.［Methods］Collecting 20 patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase，11 patients were treated with imatinib，while the other 9 were treated with traditional chemical therapy.Karyotypes were analyzed by chromosome G banding in 20 cases who were monitored the level of bcr-abl fusion gene by RT-PCR before and after administrating imatinib or traditional chemical therapy.Evaluate the rates of CHR，CyR，MoR.［Results］All the patients treated with imatinib got complete hematological response(CHR)，9 of which had negative ph chromosome and bcr-abl fusion gene.The cytogenetic response(CyR)response rate is 81%.To patients with traditional chemical therapy，CHR rate is 100%，but no one got CyR.［Conclusion］Imatinib significantly improves cytogenetic and molecular response rates of patients with chronic myeloid leukemia，which is better than traditional chemical therapy.

Key words:chronic myeloid leukemia;Philadelphia chromosome;bcr-abl fusion gene;Imatinib

R733.7

A

1671-7295(2012)05-0465-04

2012-05-15;

2012-08-28

李 莉(1972-)，女，遼寧丹東人，副教授。E-mail:lilydlmu@hotmail.com

閆金松，教授。E-mail:yanjsdmu@gmail.com