人肺癌細胞、組織中BRCA1蛋白的表達及與順鉑化療的相關性研究

王 紅* 秦海峰 王春楊 張金山

(1 解放軍307醫院肺部腫瘤科，北京100071；2 解放軍301醫院泌尿外科，北京100853；3 第四軍醫大學組織胚胎學教研室，陜西 西安710033）

乳腺癌相關蛋白有很多種，其中BRCA1是作重要的一種，源于腫瘤抑制基因之一（抑癌基因），且位于染色體17q21區域，它的功能和雙鏈DNA損傷后修復有關。BRCA1蛋白由N末端和C末端以及中間ATM，ATR的磷酸化區組成。如果有BRCA1基因突變的患者到40歲前其乳腺癌的患病風險比極高。許多研究已經提示了其在散發型乳腺癌和卵巢癌中的重要作用[1]；很多證據證實BRCA1 在各種細胞活動過程中參與以下功能：如DNA 修復，細胞周期，結節點阻滯，轉錄調節和凋亡，和染色體重建[2-5]，但BRCA1在肺癌組織的分布及其作用近年鮮有報道，本文就是研究BRCA1蛋白在肺癌組織中的分布和特性以及是否與順鉑化療預后相關并進行了討論。

1 材料與方法

1.1 材料、標本和試劑

確診肺癌手術切除并經病理組織學證實病例存檔石蠟包埋標本60例。共60例肺癌標本：其中來自解放軍307醫院病理科確診肺癌病例（經病理學證實）的存檔石蠟包埋標本15例（2001年1月至2008年1月），1995年1月至2000年12月西京醫院確診肺癌手術切除并經病理組織學證實病例存檔石蠟包埋標本10例，第四軍醫大學組胚教研室肺癌手術切除并經病理組織學證實石蠟包埋存檔標本35例。年齡29～75歲，平均55歲。

熒光顯微鏡（Olympus BX-60），小鼠抗人BRCA1單克隆抗體（CAlBIOCHEM），FITC標記的和Avidin-Texas red 標記的二抗（山羊抗小鼠IgG，molecular probe公司），蘇木精和伊紅染色用試劑。

1.2 方法

1.2.1 組織切片制備

石蠟包埋肺癌組織切成5mm的方塊，經甲醛固定后梯度脫水、浸蠟過夜高溫包埋。石蠟切片機進行切片，成5～8μm石蠟切片，經處理后準備做抗體染色或HE染色。

1.2.2 細胞株的培養

人乳腺癌MCF-7和人非小細胞肺癌細胞株NCI=H460 由實驗室提供。于37℃、5%CO2條件下培養，培養基為含10%胎牛血清的RPMI1640。取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.3 免疫熒光雙重染色和免疫熒光顯微鏡觀察

細胞陽性對照 無菌操作在潔凈臺下用鑷子放無菌的蓋玻片在6孔板中，消化后的MCF-7用DMEM培養液懸浮后到培養皿中，每個細胞數量106個，細胞貼壁后乙醇中固定10min，pH值適中0.01mmol/L PBS沖洗充分后與組織切片以血清封閉，充分浸潤BRCA1第一抗體（稀釋比例1：100，molecular probes）4℃過夜。第二抗體Avidin-Texas red –山羊抗小鼠（稀釋比例1∶400，molecular probes）室溫浸潤4h。0.01mmol/L PBS沖洗后以DAPI復染，甘油熒光封片劑封片待觀察計數。顯微鏡觀察時每個病例取5組切片，每張切片讀取10個高倍視野約400個腫瘤細胞。HE染色對照。

1.2.4 結果判定

BRCA1蛋白主要表達在細胞核和細胞質中；病例中BRCA1表達分布不均勻。有些以細胞核為主，BRCA1蛋白主要分布在細胞核和核膜；有些病例以細胞漿為主，存在于細胞漿；另外一些病例胞漿和胞核均有BRCA1分布。每例隨機觀察10個高倍視野約500個腫瘤細胞，均按照半定量積分法評分：陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分。染色強度：分為1、2、3分。細胞陽性率與染色強度兩者積分相乘：0分為（-），1-4分為弱陽性（+），5-8分為中度陽性（++），9-12分為強陽性（+++）。

1.2.5 臨床病例資料

共60例肺癌標本：其中來自解放軍307醫院病理科確診肺癌病例（經病理學證實）的存檔石蠟包埋標本15例（2001年1月至2008年1月），1995年1月至2000年12月西京醫院確診肺癌手術切除并經病理組織學證實病例存檔石蠟包埋標本10例，第四軍醫大學組胚教研室肺癌手術切除并經病理組織學證實石蠟包埋存檔標本35例。年齡29～75歲，平均55歲。

1.2.6 統計學處理

所有數據均采用 表示，采用SPSS 11.0軟件統計處理，Spearman相關分析與臨床特征的關系，檢驗分析與預后因素的相關關系，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BRCA1蛋白在人肺癌組織的表達和三種類型

免疫熒光染色實驗和熒光顯微鏡的形態學觀察結果證實肺癌組織存在BRCA1蛋白表達，全部60例肺癌組織中有42例（70%）標本細胞表達BRCA1：且其中有24% BRCA1蛋白在細胞核分布，40.3%胞核、胞漿同時存在，35.7%只在胞漿中存在BRCA1蛋白（圖1和圖2）。

圖1 BRCA1陽性病例中肺癌組織中BRCA1細胞分布類型

圖2 BRCA1蛋白在肺癌組織的分布(X100)

2.2 BRCA1蛋白表達及其分布在肺癌組織的核、漿比例不同（圖2）。BRCA1蛋白在一些病例有出核現象，BRCA1的組織分布有核漿比例改變：甚至有部分細胞BRCA1蛋白在細胞核沒有分布，僅在細胞漿可以觀察到BRCA1的分布，這樣的病例有15個包埋標本，比例是35.7%（圖1）。對于50%以上肺癌患者的組織切片BRCA1蛋白在細胞核和漿分布比例均勻，BRCA1蛋白在細胞漿的細胞分布比例是31%～47%。

2.3 BRCA1蛋白低表達和高表達與順鉑化療的相關性分析

全部60例肺癌組織有70%的肺癌標本細胞表達BRCA1：其中15個包埋標本（35.7%）僅在細胞漿可以觀察到BRCA1的分布；另有17 包埋標本（40.3%，其表達情況見圖1）細胞漿和細胞核均可觀察BRCA1表達，且有24% 包埋標本中BRCA1蛋白在細胞核分布。結果判定按照以下標準：1～4分：弱陽性（+），5～8分：中度陽性（++），9～12分：強陽性（+++）。

將全部BRCA1表達陽性病例標本回顧性分析與BRCA1低表達和高表達的結果（表1和表2）：BRCA1表達水平與性別、年齡、等（P=0.512、P=0.244、P=0.317）分層觀察無關，與PS評分呈正相關；BRCA1蛋白表達程度對含順鉑方案輔助化療的預后影響（P＜0.05）有顯著意義。40%（24 of 60）的患者有低中水平（弱陽性、中等強度陽性）表達 BRCA1，30% （18 of 60）有高水平 BRCA1表達（強陽性）（P=0.01）；低中表達水平BRCA1組的中位生存期為 120 月，高 BRCA1 水平的患者為34月（P＜0.05）。回顧性生存率的單因素分析，BRCA1表達水平是獨立的預后因素。經相關檢驗，BRCA1蛋白表達與順鉑化療的預后呈負相關（P＜0.05）（表1和表2）。

表1 肺癌組織中BRCA1表達與肺癌臨床病理特征的相關性

表2 肺癌組織中BRCA1表達陽性病例數與順鉑化療的相關性

3 討 論

近年來有關文章報道BRCA1在乳腺、卵巢腫瘤細胞的分布很明確[6,7]，并在DNA 修復，細胞周期，轉錄調節和細胞凋亡等功能中有相應的重要作用，但是關于BRCA1在肺腫瘤的分布和相關功能報道鮮為人知，本研究首次證實了BRCA1蛋白在人類肺癌細胞存在。

BRCA1蛋白功能的研究表明它是一種細胞核、細胞漿的出核互動蛋白[8]。尤其是在乳腺腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞中照射后其出核現象和功能的討論有很多相關報道[9-10]。本研究結果明確表明肺癌的BRCA1蛋白表達也存在細胞核、細胞漿的互動現象（圖1和圖2）；但和以往關于其他腫瘤的研究結果不同，BRCA1蛋白表達在細胞漿和細胞核同時存在的比例（40.3%）遠遠高于其僅在細胞核分布的比例（24%），這是否給予我們提示肺癌組織中BRCA1表達不僅僅是與DNA修復等細胞核功能相關，還參與細胞漿中腫瘤相關信號轉導通路。

BRCA1蛋白 低表達和高表達與順鉑化療的相關性分析：本研究重點是發現了肺癌組織的BRCA1蛋白表達（圖1和圖2），但發生BRCA1蛋白的核漿比例改變在肺癌組織很特殊，并且與腫瘤發生發展機制和功能可能有密切關系。本研究還發現，低中表達水平BRCA1組的中位生存期為 120個月，高表達 BRCA1 水平的患者為34個月（P＜0.05）。回顧性生存率的單因素分析，BRCA1表達水平是獨立的預后因素。經相關檢驗，BRCA1蛋白表達與經順鉑輔助化療的患者預后呈負相關（P＜0.05）（表1和表2）。有一點值得注意的是：高表達 BRCA1水平的包埋標本中BRCA1往往在細胞核中分布。這就提示BRCA1在細胞核中強陽性分布可能是參與DNA修復而保護了細胞，而在細胞漿分布、低中水平陽性分析與BRCA1參與細胞凋亡信號轉導過程有關，細胞對順鉑更敏感。這就給臨床上檢測BRCA1表達水平提供了強有力的實驗室證據，如果提前預知對鉑類輔助化療的敏感性相關因素，進而能夠通過化療延長肺部腫瘤患者的生存，無疑是對臨床的指導意義令人激動人心，原因是肺癌是全世界癌癥相關死亡的最主要原因[11]，肺癌病例中大約85%～90%為非小細胞肺癌（NSCLC）。

綜上所述，我們得出以下結論：①BRCA1蛋白肺癌組織細胞表達，其正常分布比例為細胞核占24%，細胞核與漿占40.3%，細胞漿占35.7%。② 其漿核分布有特點，即BRCA1在肺癌組織有蛋白出核現象。這就進一步提示BRCA1可能具有與肺癌的發生相關的蛋白特性。③BRCA1在 DNA 修復通路中的核心作用，低 BRCA1 表達與對 順伯敏感相關，提示延長肺癌患者生存的新思路。

[1] Rahman N,Stratton MR.The genetics of breast cancer susceptibility[J].Annu Rev Genet,1998,32： 95-121.

[2] Kerr P,Ashworth A.New complexities for BRCA1 and BRCA2 [J].Curr Biol,2001,11(16)：R668-R676.

[3] Pierce AJ,Stark JM,Araujo FD,et al.Double-strand breaks and tumorigenesis[J].Trends Cell Biol,2001,11(11)： S52-S59.

[4] Scully R,Puget N,Vlasakova K.DNA polymerase stalling,sister chromatid recombination and the BRCA genes [J].Oncogene,2000,19(53)： 6176-6183.

[5] Venkitaraman AR.Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2[J].Cell Growth Differ,2002,108(2)： 171-182.

[6] Lee Y,Miron A,Drapkin R,et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube[J].J Pathol,2007,211(1)：26-35.

[7] Lee WY,Jin YT,Chang TW,et al.Immunolocalization of BRCA1 protein in normal breast tissue and sporadic invasive ductal carcinomas： A correlation with other biological parameters [J].Histopathology,1999,34(2)：106-112.

[8] Rodriguez JA,Henderson BR.Identification of a functional nuclear export sequence in BRCA1 [J].J Biol Chem,2000,275(49)：38589-38596.

[9] Feng ZH,Kachnic L,Zhang JR,et al.DNA damage induces p53-dependent BRCA1 nuclear export[J]. J Biol Chem,2004,279(27)：28574-28584.

[10] Fabbro M,Rodriguez JA,Baer R,et al.BARD1 induces BRCA1 intranuclear foci formation by increasing RING-dependent BRCA1 nuclear import and inhibiting BRCA1 nuclear export [J].J Biol Chem,2002,277(24)： 21315-21324.

[11] Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2008[J].CA Cancer J Clin,2008,58(2)：71-96.