疊加對(duì)比氣相色譜法在中藥含量測(cè)定中的應(yīng)用

徐國(guó)防 李 爽 紀(jì) 佳

（鄭州人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

中藥包括中草藥和中成藥，在我國(guó)的應(yīng)用已經(jīng)有上千年的歷史，在世界上也受到了越來(lái)越多的關(guān)注和開(kāi)發(fā)應(yīng)用。過(guò)去，中藥的定量只要稱量一下藥材的重量即可，現(xiàn)在越來(lái)越需要測(cè)定出其中有效成分的精確含量，但中藥成分特別復(fù)雜多樣，在測(cè)定一些揮發(fā)性成分時(shí)，采用氣相色譜法常難以尋找到合適的內(nèi)標(biāo)。本文在疊加對(duì)比法理論[1]的基礎(chǔ)上，結(jié)合氣相色譜法的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了疊加對(duì)比氣相色譜測(cè)定中藥成分的試驗(yàn)方案。

表1 線性回歸數(shù)據(jù)和最低檢測(cè)限

疊加對(duì)比法[1]，即在色譜圖中選取與待測(cè)成分色譜峰的保留時(shí)間和峰面積相近的穩(wěn)定色譜峰作為參比峰（相當(dāng)于內(nèi)標(biāo)峰），用待測(cè)成分峰面積與參比峰之比代替峰面積的絕對(duì)值的定量方法。計(jì)算公式如下：

式中：Ai為待測(cè)成分的峰面積；Ai′為增加待測(cè)成分純物質(zhì)△mi后，再進(jìn)樣，待測(cè)成分的峰面積；Ar為參比峰的峰面積；Ar′為增加待測(cè)成分純物質(zhì)△mi后，再進(jìn)樣，測(cè)得的參比峰的峰面積。

1 儀器與試藥

Agilent 6890N型氣相色譜儀配FID檢測(cè)儀（美國(guó)安捷倫公司）；ChemStation工作站（美國(guó)安捷倫公司）；BS110 S電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；泌尿?qū)庮w粒（自制，批號(hào)：20080901，20080923，20081009）；五味子甲素（批號(hào)：0764-200006）、五味子乙素（批號(hào)：0706-200003）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為：HP-5 Phenyl Methyl Siloxane capillary column （30.0 m×0.32mm，0.50μm）；載氣：高純度N2；載氣流速：1.2mL/min；檢測(cè)器：氫焰離子化檢測(cè)器（FID）；燃?xì)鉃椋簹錃猓?0mL/min）和空氣（300 mL/min）；檢測(cè)器溫度：280℃，進(jìn)樣口溫度：230℃；進(jìn)樣量：1μL；分流比：1∶50；升溫程序?yàn)椋?50 ℃維持3 min后，以10℃/min的速度升至210℃，接著以5 ℃/min的速度從210℃升至240℃，再以10 ℃/min的速度升至280℃，維持5min。在上述色譜條件下測(cè)定，各待測(cè)成分色譜峰、參比峰之間及與其他共存成分色譜峰之間能夠達(dá)到基線分離，各待測(cè)成分色譜峰、參比峰的理論塔板數(shù)均不低于3000。色譜圖見(jiàn)圖1A。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取泌尿?qū)庮w粒12.0g，照《中國(guó)藥典》2010年版一部 附錄X D揮發(fā)油測(cè)定法提取，用正己烷萃取，再用無(wú)水硫酸鈉脫水處理后，用正己烷定容至25mL，得儲(chǔ)備供試液。將1.0mL儲(chǔ)備供試液用正己烷稀釋至10mL，用微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品適量，混合，用正己烷溶解，得到濃度分別為0.0600和0.240 mg/mL的混合儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液。另取上述儲(chǔ)備供試液1.0mL，再加入1.0mL上述混合儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液，用正己烷稀釋并定容至10mL，用微孔濾膜濾過(guò)，即得對(duì)照品溶液。

2.3 線性試驗(yàn)

取已知含量的顆粒劑12g，精密稱定，置圓底燒瓶中，照“供試品溶液的制備”方法制成儲(chǔ)備供試液。精密量取5份該儲(chǔ)備供試液各0.5mL分別置于10mL的量瓶中，在其中4份溶液中依次加入0.5、1.5、2.5、3.5mL儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液。將以上5份溶液加正己烷稀釋至刻度，混勻，進(jìn)樣分析，每份兩針，記錄色譜圖，求每份樣品中待測(cè)成分峰面積與參比峰峰面積比的平均值，再將此峰面積比的平均值與溶液中待測(cè)成分的濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。逐步稀釋溶液，測(cè)定最低檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 供試品溶液（圖A）和對(duì)照品溶液（圖B）色譜圖峰：1-五味子甲素；2-五味子乙素；3-參比峰

2.4 精密度和回收率試驗(yàn)

取供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算五味子甲素、乙素色譜峰峰面積與參比峰峰面積比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)方法的精密度良好。

表2 精密度測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

取已知含量的泌尿?qū)庮w粒樣品共9份，每份6.0 g，分別精密稱定，加入8.0，10.0，12.0mL混合儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液各3份。將所得的9份樣品分別置于圓底燒瓶中，照上述方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，測(cè)定加對(duì)照品后的含量。計(jì)算回收率（recovery）：

式中，mtotal是測(cè)得的總量，moriginal 是未加對(duì)照品時(shí)已知樣品中的含量，mspiked是加入的對(duì)照品的量。結(jié)果五味子甲素、五味子乙素的回收率分別為：96.7% （RSD 3.6%），99.3%（RSD 4.8%），表明方法的準(zhǔn)確度基本良好。

2.5 樣品測(cè)定

取3批不同批號(hào)的樣品，按“供試品溶液的制備”和“對(duì)照品溶液的制備”項(xiàng)下操作制備供試品溶液和對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下測(cè)定，分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。分析供試品溶液色譜圖和對(duì)照品溶液色圖譜，選擇與待測(cè)成分色譜峰保留時(shí)間和峰面積相近的穩(wěn)定色譜峰作為參比峰，按疊加對(duì)比法計(jì)算顆粒劑中五味子甲素等兩種成分的含量：

式中：mi為待測(cè)成分i的含量，單位mg?g-1；Ci為混合儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液中i成分的濃度，單位mg?mL-1；Ai為供試品溶液待測(cè)成分（i）的峰面積，Ai′為對(duì)照品溶液i成分峰面積；Ar為供試品溶液參比峰的峰面積；Ar′為對(duì)照品溶液參比峰的峰面積；W為樣品稱樣量，單位g。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

疊加法的理論研究和應(yīng)用較早[2,3]，但限于技術(shù)等原因，應(yīng)用范圍不廣。隨著儀器分析技術(shù)的發(fā)展和復(fù)雜樣品分析工作的需要，疊加對(duì)比法開(kāi)始應(yīng)用于分析領(lǐng)域[4,5]，孫國(guó)祥教授等還對(duì)毛細(xì)管電泳疊加對(duì)比法的測(cè)定誤差進(jìn)行了理論推導(dǎo)[6]。疊加對(duì)比法用相對(duì)峰面積替代了峰面積的絕對(duì)值，因此可以克服外標(biāo)法中進(jìn)樣量不準(zhǔn)確、儀器波動(dòng)等所帶來(lái)的定量誤差。該法還巧妙的利用了樣品中原有成分的色譜峰作為參比峰，避免了內(nèi)標(biāo)法在分析復(fù)雜樣品時(shí)較難找到合適的內(nèi)標(biāo)物或者色譜峰過(guò)于密集，無(wú)處可插入內(nèi)標(biāo)峰的困惑。總之，疊加對(duì)比法雖然不加內(nèi)標(biāo)物，卻具有內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于分析成分復(fù)雜的樣品，如中藥等。

根據(jù)參比峰的選擇原則，一般可以在進(jìn)樣多次后選取與待測(cè)成分色譜峰的保留時(shí)間和峰面積相近且穩(wěn)定的色譜峰作為參比峰。參比峰只需要在同一批測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液中保持相對(duì)的穩(wěn)定（峰面積和保留時(shí)間的變化僅是由于進(jìn)樣量不準(zhǔn)確、儀器波動(dòng)等偶然因素引起的，不包括參比成分不穩(wěn)定等引起的變化）即可，而不必要在所有的樣品中均保持穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)一定的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，甚至還可以選取不同的待測(cè)成分（即已知成分）色譜峰相互作為參比峰。

[1] 孫毓慶,王延琮.現(xiàn)代色譜法及其在藥物分析中的應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社,2005：279-280.

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[5] 孫國(guó)祥,孫毓慶,李陽(yáng),等.毛細(xì)管電泳疊加對(duì)比法測(cè)定復(fù)方降壓片中5組分含量[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,19(4)：265-268.

[6] 孫國(guó)祥,鄧湘昱,萬(wàn)月生,等.毛細(xì)管電泳疊加對(duì)比法的誤差分析[J].中南藥學(xué),2004,2(5)：266-268.