轉TCS基因泡桐對土壤微生物的影響1)

高尚坤

(山東農業大學，泰安，271018)

劉 靜 黃艷艷 羅 磊 馮殿齊

(泰安市泰山林業科學研究院)

劉玉升 牛慶霖

(山東農業大學)

自 1983 年轉基因植物［1－2］首次問世以來，轉基因植物的開發與應用得到了突飛猛進的發展。但轉基因作物的大面積種植極有可能對農林生態系統產生多方面的危害。因此，對其釋放后的生態風險評價極為必要。目前，有關轉基因農作物的生物安全研究較多，其中主要涉及對非目標昆蟲、農田生態系統影響以及基因漂移等，如對轉基因的棉花［3－9］、水稻［10］、煙草［11］、枸杞［12］等農作物和經濟作物對土壤微生物生態風險評價有大量研究，但在轉基因林木方面的報道很少［13］。林木轉基因生物安全性主要包括轉基因的穩定性、外源基因向天然群體的基因漂移及對非目標生物的影響等［14］。

土壤微生物的多樣性是保持農業生態系統穩定的基礎。微生物普遍存在于土壤中，對環境條件的變化反應敏捷，它能較早地預測土壤養分及環境質量的變化過程，被認為是最有潛力的敏感性生物指標之一。研究表明，轉基因作物的外源基因和基因表達產物可通過根系分泌物或殘茬進入土壤生態系統，進而對土壤微生物多樣性造成影響。土壤中的微生物在農業生產系統中具有其他生物無法代替的作用，隨著各種抗蟲、抗病等轉基因作物的不斷選育種植，這種變化對土壤微生物存在潛在危險而可能造成對農業生產系統的影響［15－20］。

泡桐［Paulownia fortunei(seem.)Hemsi］為玄參科泡桐屬植物，原產我國，現分布于世界各地。因材質優良，速生豐產，從而成為重要的用材樹種和綠化樹種，廣泛用于建筑、樂器和工藝品的制作以及園林綠化［21］。但由于泡桐叢枝病嚴重影響了畸形、幼苗枯死、大樹生長緩慢，給泡桐生產造成了很大的影響，嚴重打擊了農民種植泡桐的積極性。經研究通過轉抗叢枝病TCS基因進行該病的控制，并成功獲得了轉基因株系，經多年試驗，該株系表現良好，為更快、更安全地進行示范推廣，本文采用平板培養法分析了轉基因泡桐對根際土壤微生物群落數量的影響，并系統的研究了細菌菌群，為轉基因泡桐環境釋放后對土壤生態系統的影響提供了依據。

1 試驗地概況

轉抗病TCS基因泡桐位于菏澤市定陶縣孟海鎮牛屯試驗地，面積約667 m2，為黃河沖擊平原，北緯32°41″，東經115°36″;年平均氣溫 10.1 ℃，月平均最高溫度25.6℃，最低1月份－0.7℃;全年日照時數 2035.5 h，年降水量 250.4 mm;砂壤土，pH 值7.8。試驗地周圍是農田及行道樹107黑楊。

2 材料與方法

供試材料來源于試驗田中的轉基因株系、非轉基因株系和非根際土壤(對照組);每個組分別采集3個單株土樣，各單株樹齡相當，田間管理一致。

培養基為:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(簡稱NA培養基)、馬鈴薯瓊脂培養基(簡稱PDA培養基)、高氏1號培養基。

土壤取樣方法:采用3點取樣法。從轉基因泡桐和非轉基因泡桐試驗地根際周圍采集土樣;采集時除去地面植被和枯枝落葉，鏟除表面1 cm左右的表土，用取樣器取離地表10 cm左右的土樣;剔除雜物，轉入干凈的保鮮袋中帶回實驗室進行測定。

土壤微生物種類測定:采用稀釋平板法測定土壤微生物的數量與種類。具體操作方法:①對于采集的土樣，用1/1000天平準確稱取10 g后加入盛有90 mL無菌水的三角瓶中，在振蕩器上振蕩30 min，使土樣均勻分散，得到質量濃度為10－1g/mL土壤懸濁液。②充分渦旋后立即吸取1 mL懸濁液加至盛有9 mL無菌水的試管中，得到質量濃度為10－2g/mL懸濁液。按照此方法，依次將土壤懸濁液稀釋，細菌測試時將土壤懸濁液稀釋至 10－5、10－6、10－7g/mL、真菌測試時將土壤懸濁液稀釋至 10－2、10－3、10－4g/mL、放線菌測試時將土壤懸濁液稀釋至10－4、10－5、10－6g/mL。③細菌的分離、培養采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(簡稱NA培養基)，真菌的分離、培養采用馬鈴薯瓊脂培養基(簡稱PDA培養基)，放線菌的分離、培養采用高氏1號培養基。④細菌的分離與純化時取土壤懸濁液質量濃度為10－5、10－6、10－7三個稀釋度，真菌的分離與純化時取土壤懸濁液質量濃度為 10－2、10－3、10－4三個稀釋度，放線菌的分離與純化時取土壤懸濁液質量濃度為 10－4、10－5、10－6三個稀釋度;并且各吸取 0.2 mL至預先制備好的平板培養基上，用涂布法進行分離，各稀釋度重復3次，分別置于30℃的GXZ型智能光照培養箱和YQX型厭氧培養箱中培養72 h。對于細菌，挑取表征各異的菌落，在NA劃線、純化，將純化后的菌落分別劃NA培養基斜面培養，并依次編號;對于真菌和放線菌，根據菌株的培養性狀，結合顯微鏡觀察，對菌株依次編號。

土壤微生物的數量測定:對已編號的真菌和放線菌，進行培養性狀觀察，采用刮板接種法計數。每毫升土壤懸浮液中菌落數=(菌落平均數×稀釋倍數×20)/干土的百分數，所用數據用 Microsoft Excel 2003進行處理，計算平均值和標準偏差。

無菌條件下，將土壤細菌懸浮液按不同比例稀釋，取質量濃度為 10－5、10－6、10－7g/mL 三個稀釋度的定量懸浮液，分別在NA培養基平板上涂抹，30℃培養72 h。選取菌落稀疏適當的平板計算細菌菌落數，并求取3個重復的平均值，計算出每克或毫克土壤懸浮液中的細菌數。每毫升懸浮液內細菌數≈(平板菌落數×土壤懸濁液質量濃度)/平板加液量。所用數據用Microsoft Excel 2003進行處理，計算平均值和標準偏差。

土壤真菌和放線菌的種群鑒定:通過對真菌菌落的大小、形態、色素、顏色和質地等形態進行觀察，對3組土壤中真菌和放線菌種類進行初步鑒定。

土壤中細菌的種群鑒定:對純化后已編號的各細菌菌株，進行革蘭氏染色［22］、芽孢染色、鞭毛染色、生理生化測定等試驗，并按《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版進行鑒定［23－26］。

3 結果與分析

3.1 土壤中微生物數量

利用刮板接種法對不同土樣的真菌、放線菌菌落數量進行計數，同時利用平板菌落計數法對細菌進行計數(見表1)。由表1可以看出:與非根際土壤對比，轉基因泡桐根際的微生物類群沒有發生變化，以細菌為主要微生物群，其次是真菌和放線菌。從不同土樣微生物數量看出，以轉基因細菌群落的數量最大，其次是真菌和放線菌。

表1 土壤微生物群落計數 個·mL－1

3.2 土壤中真菌和放線菌的種群鑒定

通過對真菌菌落的大小、形態、色素、顏色和質地等形態進行觀察發現，3組土壤中真菌種類相同，主要為毛霉屬(Mucor)和根霉屬(Rhizopus)。種群數量，毛霉屬為 1.0×103個/mL、根霉屬為 2.0×103個/mL;3組土壤中均發現一種放線菌，其種群數量為2.0×103個/mL。

3.3 土壤中細菌的種群鑒定

對土壤細菌進一步分離、純化及培養觀察，共有18個細菌菌株，其中從轉基因株系組、非轉基因株系組、對照組中均獲得6個細菌菌株;經培養性狀比較，相同菌株保留一株，經整理統一編號后，分別編號為1～6號、1～3號和1～2號。

3.3.1 供試菌株菌體形態和培養性狀

將供試菌株在NA培養基上培養24 h，按照革蘭氏染色法和3%KOH簡易法，調查革蘭氏陰性反應情況。經油鏡和林鎢酸鈉復染法電鏡觀察菌體形態、鞭毛有無及部位、芽胞有無等性狀，將分離純化的供試菌株在NA和NB培養基上，28℃培養48 h后觀察培養性狀(見表2)。從表2中可看出:轉基因株系組6個菌株菌體形態除3號為短桿型，其余均為長桿型，革蘭氏染色均為陽性;除5號周生鞭毛外，其余均無周鞭毛生長;3號菌無芽胞生長，其余均有芽胞生長。非轉基因株系組中的1號為短桿型;2號、3號菌株為周生鞭毛。非根際土壤中，1號為短桿型，2號為長桿型，均無周生鞭毛。由此得出:3個樣品菌種發生了變化。

表2 土壤細菌的形態特征及培養性狀

3.3.2 供試細菌菌株生理性狀

將供試細菌菌株在不同溫度、不同pH值和不同NaCl質量分數條件下，接種培養不同時間，觀察生理性狀(見表3)。從表3中可知:供試菌株在不同溫度、不同pH值和不同NaCl質量分數下培養，轉基因株系組中的1號和3號、非轉基因株系組中的3號和對照組的2號，可在15℃下生長;所有菌株在30～37℃條件下、在pH值5～9條件下、在NaCl質量分數2% ～7%條件下，均生長良好。

表3 土壤細菌的生理性狀

3.3.3 供試菌株生化性狀

對供試11個菌株生化性狀測定:氧化酶等4種，6種氮素化合物和糖醇以及其他碳素化合物19種(見表4)。從表4可知:供試11個菌株，除賴氨酸脫羧酶非轉基因株系組中的2號菌株陰性，其他菌株均為陽性;過氧化氫酶、吲哚和鳥氨酸脫羧酶為陽性;除轉基因株系組中的1號菌株不能使明膠液化，其他菌株均可以;除轉基因株系組中的1號菌株能利用麥芽糖和棉籽糖外，其他糖醇均不能利用;發現各組各菌株其他生化測定項目各異。

表4 土壤細菌生化測定結果

表4 (續)

3.3.4 細菌菌株鑒定及其存在數量狀況

經對應和檢查菌體形態、染色反應、培養性狀、生理生化反應等各項指標，綜合鑒定結果見表5。由表5可見，①轉基因株系組的6個菌株及數量，分別為:嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)60×106個/mL、環狀芽孢桿菌(B.circulans)30×106個/mL、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter sp.)15×106個/mL、堅強芽孢桿菌(B.firmus)3×106個/mL、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)1×106個/mL、短小芽孢桿菌(B.pumilus)均為1×106個/mL。②非轉基因株系組的6個菌株及數量，分別為:短小芽孢桿菌(B.pumilus)1×106個/mL、蜜蜂芽孢桿(B.bee)3×106個/mL、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)1×106個/mL、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)2×106個/mL、堅強芽孢桿菌(B.firmus)1×106個/mL、蜂房芽孢桿菌(B.hive)3×106個/mL。③對照組(非根際土壤)的6個菌株及數量，分別為:嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)5×105個/mL、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)1×105個/mL、環狀芽孢桿菌(B.circulans)4×105個/mL、蜂房芽孢桿菌(B.hive)2×105個/mL、短小芽孢桿菌(B.pumilus)為 1×105個/mL、浸麻芽孢桿菌(B.macerans)7×105個/mL。綜合以上結果可見:轉基因泡桐根際土壤與對照相比細菌種類及數量明顯增多，真菌和放線菌種類和數量沒有發生很大變化;真菌菌群中以毛霉屬和根霉屬為主，細菌菌群中以芽孢桿菌屬為主，但對土壤微生物的多樣性無影響。

表5 土壤細菌鑒定結果、分布情況及數量

4 結論與討論

在細菌種類上:除在轉基因株系根際土壤中存在檸檬酸桿菌屬外，其余菌株均屬于芽孢桿菌屬。其中嗜熱脂肪芽孢桿菌在轉基因株系、非轉基因株系和非根際土壤中均分離得到;球形芽孢桿菌和蜂房芽孢桿菌，只在非轉基因株系和非根際土壤中分離得到;環狀芽孢桿菌，只在轉基因株系和非根際土壤中分離得到;堅強芽孢桿菌，在非根際土壤中沒有分離得到，在其他兩個株系根際周圍分離得到;球形芽孢桿菌和蜂房芽孢桿菌，在非轉基因株系和非根際土壤中均分離得到，在轉基因株系中均未分離到。

在細菌數量上:轉基因株系根際土壤中的細菌數量為1.10×108個/mL，非轉基因株系根際土壤中的細菌數量為1.1×107個/mL，非根際土壤中的細菌數量為2.0×106個/mL，表明轉基因后細菌數量明顯增加。

結果表明:轉基因泡桐根圍的土壤微生物數量都有變化，其中細菌菌群數量變化最大，但轉基因泡桐根圍土壤微生物的總體構成變化不大，仍以細菌數量最多，真菌和放線菌次之;在細菌菌群中，以芽孢桿菌屬的細菌為主。說明轉基因泡桐對土壤微生物的數量有一定影響，但對土壤微生物的多樣性無影響。

本研究是通過稀釋平板法進行土壤微生物的分離測定，現今把分子生物學技術運用于土壤微生物生態學，可以避開傳統的分離培養過程，通過DNA水平上的研究，直接探討土壤微生物的種群結構及其與環境的關系。而且可結合16S rDNA序列分析研究原核微生物群落多樣性技術，更為精確地揭示土壤中微生物種群結構及其動態變化［27－29］。

另外，本文只對秋季落葉后轉基因株系、非轉基因株系根際土壤和非根際土壤微生物群落進行了研究，對于不同的季節的土壤微生物群落變化及相同季節的土壤微生物群落穩定性差異，有待進一步研究。

轉抗病TCS基因泡桐可以有效減輕泡桐叢枝病的發生，降低泡桐經濟和生態效益損失，有利于林業可持續生態系統的建立，對于其他林果木叢枝病(如棗瘋病)的防治具有重大指導意義。因此，對于轉抗病TCS基因泡桐的安全釋放問題需進一步跟進和完善。

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