雪荔組方水提醇沉液的HPLC指紋圖譜研究*

胡巍，陳明磊，方蕓??

雪荔組方水提醇沉液的HPLC指紋圖譜研究*

胡巍1，陳明磊2，方蕓1??

1南京大學醫學院附屬鼓樓醫院臨床藥學室，南京210008；2南京中醫藥大學，南京210046

采用HPLC建立雪荔組方的指紋圖譜，以Agilent HC-C18柱，乙腈-冰醋酸為流動相進行梯度洗脫，流速為0.8m L·m in-1，檢測波長為335 nm。根據10批供試品指紋圖譜，確定了14個共有峰，相似度均大于0.95。

雪荔組方；指紋圖譜；高效液相色譜法

雪荔組方由荔枝草、車前草、六月雪、紫花地丁等4味中藥組成，具有清熱解毒、利尿消腫等功效，臨床常用于治療尿路感染[1]。組方中藥含有黃酮、環烯醚萜苷等多種化學成分。現代研究證明，荔枝草等具有顯著的抑菌[2]、抗炎[3]等作用。現采用指紋圖譜技術用于雪荔組方的質量控制。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器（DAD）、Agilent chemstation工作站（美國安捷倫公司）。

1.2 試藥

高車前苷對照品（純度＞98%，批號：20120128，上海醫藥工業研究院）；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

荔枝草等中藥材購自南京中藥飲片廠，經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定：荔枝草為唇形科植物荔枝草（Salvia plebeia R.Br）的全草；車前草為車前科植物車前（Plantago asiatica L.）的全草；六月雪為茜草科植物六月雪[Serissa serissoides（DC.）Druce]的全株；紫花地丁為堇菜科植物光瓣堇菜（Vida philippice Cav.）的全草。

10批雪荔組方水提醇沉液為實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

按質量比2∶2∶2∶1稱取荔枝草、車前草、六月雪、

紫花地丁共100 g，加入10倍量水加熱回流提取2次，每次2 h，合并濾液，濃縮至相對密度為1.01的清液，加入乙醇使含醇量達60%，靜置72 h，濃縮濾液并準確定容至200mL，配制成質量濃度為0.5 g· mL-1的水提醇沉液。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取高車前苷20.2mg，置于100mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配成濃度為0.202 g·L-1對照品儲備液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent HC-C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相為0.5%（V/V）冰醋酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～10min，10%～15%B；10～18 min，15%～18%B；18～25 min，18%～20%B；25～30 min，20%～22%B；30～40 min，22%～40%B；40～55 min，40%～60%B）；檢測波長為335 nm；柱溫為30℃；流速為0.8mL·min-1。

2.4 指紋圖譜的方法學考察

2.4.1 精密度試驗取同一份供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，以高車前苷色譜峰（圖1～2中第12號峰）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各共有峰的相對保留時間的RSD在0.06%～0.23%之間，相對峰面積RSD在0.90%～2.94%之間，均小于3%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗取同一份供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h取樣，按“2.3”項下色譜條件進樣，以高車前苷色譜峰（圖1～2中第12號峰）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰的相對保留時間的RSD在0.97%～1.03%之間，相對峰面積的RSD在1.32%～2.86%之間，均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.3 重復性試驗按“2.1”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.3”項下色譜條件進樣，以高車前苷色譜峰（圖1～2中第12號峰）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，供試品各共有峰的相對保留時間的RSD在0.46%～1.40%之間；相對峰面積的RSD在1.34%～2.64%之間，表明供試品溶液制備方法的重復性良好。

2.5 指紋圖譜結果及分析

2.5.1 雪荔組方水提醇沉液指紋圖譜的建立取不同批號的藥材，配制10份雪荔組方，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20μL進樣，將色譜圖導入“中藥色譜圖分析和數據管理系統”軟件，匹配時間漂移值設為0.2，并自動匹配，生成對照譜圖（R）及供試品的指紋圖譜，見圖1、圖2。

圖2 10批供試品溶液的對照譜圖

圖3 高車前苷對照品溶液色譜圖

2.5.2 雪荔組方水提醇沉液指紋圖譜技術參數通過對10批供試品溶液色譜圖的分析，最終確定共有峰14個。高車前苷為主要成分之一，將其對照品溶液按照“2.3”項下色譜條件進樣分析，與供試品溶液色譜圖進行比對，相對保留時間一致的峰為12號峰（見圖3），故選擇其作為參照峰（S），設定其保留時間和峰面積值均為1.0，計算余下各峰的相對保留時間和相對峰面積，見表1、表2。經計算，10批供試品中高車前苷含量分別為0.821、0.823、0.818、0.835、0.806、0.829、0.831、0.816、0.826、0.822 mg·g-1，平均含量為0.822mg·g-1，RSD為1.01%。

表1 共有峰的相對保留時間

2.5.3 相似度分析用“中藥色譜圖分析和數據管理系統”軟件對10批供試品溶液的色譜圖進行相似度評價，結果10批供試品溶液與生成的對照圖譜進行比較，相似度均大于0.95，見表3。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

利用DAD檢測器對190～400 nm波段進行掃描并采集三維掃描圖，綜合考慮設定波長內峰的數目、色譜峰的分離情況，最終選擇335 nm作為檢測波長。

表2 共有峰的相對峰面積

表3 10批供試品圖譜的相似度結果

3.2 流動相的選擇

本實驗先后考察了甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水、乙腈-水-冰醋酸等多種流動相體系，比較發現使用甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸作為流動相時色譜峰分離效果較差，而使用乙腈-水作為流動相時分離度較好；此外，在流動相體系中加入冰醋酸有利于得到更好的峰形，考察了加入不同比例的冰醋酸，通過比較得出加入0.5%（V/V）的冰醋酸時效果最好。

4 小結

通過測定10批雪荔組方水提醇沉液的HPLC圖譜，共標出14個共有峰，各批次間的相似度均較好，為組方提取工藝中間體的質量控制提供有效的理論依據。同時由于指紋圖譜中只有高車前苷這一成分是可知的，譜圖中其他成分還有待進一步深入研究，以保證指紋圖譜的全面性[2]。

[1]Peng MM,Fang Y,Hu W,et al.The pharmacological activities of Compound Salvia Plebeia Granules on treating urinary tract infection[J].J Ethnopharmacol, 2010,129(1):59-63.

[2]馬瑜紅，李玲，歐陽靜萍，等.荔枝草抗炎作用的實驗研究[J].時珍國醫國藥，2008，19（9）：2209-10.

[3]童延清，李暉.紫花地丁、蒲公英體外抗菌作用研究[J].中華微生物學和免疫學雜志，2003，23（9）：669.

Study on the HPLC Fingerprints of Com pound Xueli*

HU Wei1,CHEN Ming-lei2,FANG Yun1**1Department of Clinical Pharmacy,the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008;2Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210046,China

HPLC fingerprints of Compound Xueli were established to provide an effective method of its quality control.An Agilent HC-C18column was used with acetonitrile-glacial acetic acid as the mobile phase for gradient elution;the flow rate was at 0.8mL·min-1;and the detection wavelength was at 335 nm.A total of 14 common peaks were identified and the similarities among different batches were all greater than 0.95.

Compound Xueli;Fingerprint;HPLC

R927

A

1673-7806（2012）05-476-03

江蘇省中醫藥局管理項目（HZ1016KY）

胡巍，女，藥師E-mail:huwei-82@163.com

**通訊作者方蕓，女，主任藥師Tel:025-83105660

2012-08-01

2012-08-23