丹參酮ⅡA誘導NB4細胞分化與PML-RARα融合蛋白的關系

郭慶寅 伍學強 劉玉峰

1.鄭州大學第一附屬醫院兒科，河南 鄭州450000；2.北京航天總醫院血液腫瘤研究所，北京 100076

急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)以特異的染色體易位t(15；17)(q22；q21)為特征，形成PML-RARα融合基因，表達PML-RARα融合蛋白，引起RARα轉錄活化功能障礙，使粒細胞分化阻滯于早幼粒細胞階段［1］。本研究采用NB4細胞株作為體外細胞模型，通過對丹參酮ⅡA(TanⅡA)與全反式維甲酸(all-tram retinoid，ATRA)及三氧化二砷(As2O3)誘導NB4細胞分化在細胞分化形態學、免疫表型和對PML-RARαmRNA和PML-RARα融合蛋白影響的比較，探索TanⅡA誘導APL細胞分化的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養

將NB4細胞(上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院血液學研究所提供)加入含10%新生小牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中，置于37 ℃，CO2體積分數為5%的溫箱中培養。取對數生長期的NB4細胞，分別加入濃度為1.70、2.55及3.40 μmol/L的TanⅡA(中國藥品生物制品檢定所化學標準品)，同時加入濃度為0.1及1.0 μmol/L的As2O3(哈爾濱伊達藥業有限公司)、1.0 μmol/L的ATRA(美國Sigma公司)和濃度為0.01%的DMS0。分別檢測培養12、24、48、72、96、120、144和168 h時間點的多項指標。

1.2 細胞生長曲線的測定

各時間段NB4細胞用錐蟲蘭拒染法在光鏡下計數細胞。

1.3 細胞分化形態學觀察及分化抗原的檢測

NB4細胞瑞氏染色后觀察細胞形態；加入鼠抗人的PE標記的CD11b和FITC標記的CD33的抗體，用流式細胞儀檢測細胞分化抗原(CD33、CD11b)表達。

1.4 細胞PML-RARαmRN A的檢測

取4×106個NB4細胞，應用TRIzol(Life Techologies公司)按說明書抽提總RNA。氯仿相分離，異丙醇沉淀RNA。乙醇洗滌RNA 團塊，干燥并溶解RNA。經紫外分光光度計測定RNA濃度。取2.5 μL RNA加入反應體系，RT-PCR擴增檢測PML-RARα基因的 cDNA，按賽百盛技術公司(北京SBS Genetech有限公司)硅膠膜型PCR純化試劑盒說明書純化cDNA。引物和探針設計參照歐洲抗癌協作組制訂的方案［2］，cDNA加入20 μL的反應體系中(大連寶生物公司)，在Lightcycler2.0型熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR(Roche公司)。

1.5 細胞 PML-RARα融合蛋白表達水平的檢測

用Western blot檢測PML-RARα融合蛋白。將NB4細胞，經預冷PBS洗滌，加入預冷細胞裂解液后，冰上溫育20 min，離心(12 000 r/min×20 min，離心半徑為10 cm)后-80 ℃冰箱凍存。蛋白提取物經定量后，取30 μg在的聚丙烯酰胺凝膠上電泳、轉膜，3%BSA封閉，分別與抗PML抗體和辣根過氧化酶標記的二抗溫育。最后經顯色自顯影，用凝膠圖象處理系統分析灰度值和相對濃度值。

1.6 細胞內PML蛋白觀察

方法［3］，將NB4細胞離心涂片、固定，0.1%Triton 100破細胞膜、抗PML抗體(PG-M3)、FITC標記的二抗等處理后，觀察PML熒光顆粒的數量、形態和大小并相對量化核小體恢復情況。

1.7 統計學處理

統計處理軟件采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。計量資料以±s 表示，采用方差分析比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組對NB4細胞生長抑制

NB4細胞生長受抑程度隨著TanⅡA濃度的增加而增強，低濃度與中高濃度的TanⅡA在48 h后生長抑制率差異有統計學意義(F=9.93，P=0.013 6)。同時TanⅡA對NB4細胞生長抑制作用呈時間依賴性。48 h后2.55 μmol/L TanⅡA組生長抑制率強于0.10 μmol/L As203組(F=6.30，P=0.036 4)，與1.0 μmol/L As203組差異無統計學意義(F=4.02，P=0.079 9，表1)。

表1 不同濃度TanⅡ、AAs2O3及ATRA對NB4細胞生長抑制率影響的比較Tab.1 Effects of Tan ⅡA , ATRA and As2O3 with different concentration on the growth inhibition of NB4 cell lines(±s, %)

表1 不同濃度TanⅡ、AAs2O3及ATRA對NB4細胞生長抑制率影響的比較Tab.1 Effects of Tan ⅡA , ATRA and As2O3 with different concentration on the growth inhibition of NB4 cell lines(±s, %)

Compared with 2.55 μmol/L TanⅡA group ,#: P＜0.05.

Group n 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 1.70 μmol/L TanⅡA group 3 2.2±1.1 3.8±1.5 5.5±2.3# 8.7±2.2# 10.3±2.5# 13.3±3.5# 20.3±4.1# 28.7±3.5#2.55 μmol/L TanⅡA group 3 2.3±1.2 5.6±2.2 12.3±2.1 18.2±3.1 26.4±3.2 32.1±4.6 48.3±5.8 52.4±4.2 3.40 μmol/L TanⅡA group 3 2.1±0.9 8.3±1.7 15.9±3.1 20.5±3.5 28.6±2.0 50.8±41# 52.1±5.6 54.2±4.1 0.10 μmol/L As2O3 group 3 1.0±0.4 3.5±1.3 6.1±1.6# 10.6±2.3# 14.5±2.3# 21.3±2.3# 33.4±3.4# 38.4±3.5#1.0 μmol/L As2O3 group 3 2.1±0.8 6.4±2.1 13.3±2.2 20.1±2.4 27.7±3.2 49.9±4.2# 51.5±5.3 53.4±4.4 1.00 μmol/L ATRA group 3 3.5±1.1 10.3±2.0# 18.3±2.4# 254±3.2# 30.1±3.2 55.3±4.5# 561±4.2# 57.2±3.2

2.2 各組誘導NB4細胞分化的形態學變化

隨著時間的延長，TanⅡA對NB4細胞分化作用逐漸明顯，96～168 h 1.70 μmol/L TanⅡA組與其他兩組桿狀分葉核表達率差異有統計學意義(F=8.47，P=0.002 6)，2.55 μmol/L TanⅡA和3.40 μmol/L TanⅡA各時段差異無統計學意義(F=1.13，P=0.348 8)。48～168 h期間，2.55 μmol/L TanⅡA組誘導分化率強于兩組As203組(F=4.86，P=0.049 1，表2)。

2.3 各組誘導NB4細胞分化抗原表達

隨著時間的延長，TanⅡA誘導NB4細胞CDllb表達逐漸增加(表3)，而CD33表達逐漸下降，1.70 μmol/L TanⅡA組作用差于2.55和3.40 μmol/L TanⅡA組(χ2)；2.55和3.40 μmol/L TanⅡA組各時點分化抗原表達率差異無統計學意義(F=0.94，P=0.447 4) (表4)。

2.4 對NB4細胞PML-RARα mRNA的影響

實時熒光定量PCR檢測融合基因PMLRARαmRNA，顯示3組不同濃度TanⅡA樣本各時間段Ct值和濃度比率差異無統計學意義(F=11.28，P=0.083 4，表5)。

2.5 對NB4細胞PML-RARα融合蛋白的影響

3種不同濃度TanⅡA處理NB4細胞12 h時，PML-RARα融合蛋白有減少跡象，可見PML條帶的出現。3組PML的表達隨濃度增加而增加。ATRA組和兩種不同濃度的As2O3組，在24 h時間點檢測中均可見PML-RARα融合蛋白減少，PML增加的跡象(表6)。

2.6 各組對NB4細胞PML的影響

TanⅡA處理24 h起，細胞核內顆粒均見不同程度的由量多細小細胞顆粒，逐漸變為顆粒粗大、顆粒數量較少的粗顆粒。至72 h核內顆粒呈大的點狀或斑點狀，顆粒數量在15～30個之間，與正常粒細胞對照組相似。在各時間段，3種不同濃度的TanⅡA和其他所有藥物組PML熒光顆粒積分與0.01%DMSO組差異均有統計學意義(F=24.20，P= 0.038 9，圖1)。

表2 TanⅡA與ATRA和As2O3誘導NB4細胞分化率的比較Tab.2 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the morphologic changes of NB4 cell lines(±s, %)

表2 TanⅡA與ATRA和As2O3誘導NB4細胞分化率的比較Tab.2 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the morphologic changes of NB4 cell lines(±s, %)

Compared with 0.01% DMSO group, *: P＜0.05; Compared with 2.55 μmol/L TanⅡA group, #: P＜0.05.

Group n 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 0.01%DMSO group 3 3.4±0.8 3.3±0.9 3.1±0.9 3.2±0.8 5.4±1.3 46±1.2 5.4±1.4 5.6±1.8 2.55 μmol/L TanⅡA group 3 3.7±0.8 9.5±0.8* 20.7±4.4* 39.7±3.1* 64.8±5.8* 88.7±4.1* 88.6±4.8* 89.5±6.8*0.10 μmol/L As2O3 group 3 3.4±0.8 5.4±0.9*# 13.5±57*# 20.5±2.7*# 31.3±3.2*# 45.5±5.7*# 46.4±3.6*# 42.5±4.6*#1.00 μmol/L As2O3 group 3 3.5±0.9 9.4±0.9* 14.5±3.7*# 24.5±2.4*# 29.2±3.1*# 39.5±3.8*# 39.1±4.8*# 50.5±3.9*#1.00 μmol/L ATRA group 3 3.5±0.9 12.5±1.3*# 29.6±4.2*# 50.6±5.2*# 753±6.3*# 911±4.2* 91.3±7.2* 91.8±6.1*

表3 各組誘導NB4細胞分化抗原CD11b表達的比較Tab.3 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the expression of CD11b of NB4 cell lines(±s, %)

表3 各組誘導NB4細胞分化抗原CD11b表達的比較Tab.3 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the expression of CD11b of NB4 cell lines(±s, %)

Compared with 0.01% DMSO group, *: P＜0.05; Compared with 2.55 μmol/L TanⅡA group, #: P＜0.05.

Group n 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 1.70 μmol/L TanⅡA group 3 4.5±2.3 8.6±1.5* 21.2±2.3* 32.8±4.3* 43.4±4.7*# 52.9±4.7*# 55.3±2.7*# 56.1±3.2*#2.55 μmol/L TanⅡA group 3 7.2±2.1* 8.7±1.2* 23.8±2.0* 36.4±3.5* 55.7±4.6* 59.6±5.1* 66.2±5.9* 71.3±6.9*3.40 μmol/L TanⅡA group 3 7.3±2.9* 10.3±1.7* 23.2±2.1* 39.6±3.7* 56.8±5.3* 62.3±7.9* 69.1±5.3* 72.1±5.5*0.10 μmol/L As2O3 group 3 4.8±3.0 5.9±1.4*# 12.8±2.9*# 27.7±2.2*# 28.4±4.6*# 31.0±4.2*# 35.4±1.7*# 34.6±2.1*#1.00 μmol/L As2O3 group 3 4.9±2.6 7.5±1.1* 13.2±3.2*# 45.2±4.7*# 27.4±5.1*# 38.6±4.8*# 37.3±1.6*# 33.2±2.4*#1.00 μmol/L ATRA group 3 10.2±3.2* 17.7±2.8*# 34.3±3.8*# 254±3.2# 59.7±6.2* 65.3±7.6* 69.8±5.6* 72.5±6.9*0.01% DMSO group 3 2.4±1.2 2.5±1.1 2.1±0.8 1.4±1.3 2.2±0.7 1.3±0.8 2.3±1.1 1.4±0.5

表4 各組誘導NB4細胞分化抗原CD33表達的比較Tab.4 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the expression of CD33 of NB4 cell lines(±s, %)

表4 各組誘導NB4細胞分化抗原CD33表達的比較Tab.4 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the expression of CD33 of NB4 cell lines(±s, %)

Compared with 0.01% DMSO group, *: P＜0.05; Compared wiht 2.55μmol/L TanⅡA group , #: P＜0.05.

Group n 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 1.70 μmol/L TanⅡA group 3 93.6±1.1 86.5±3.5* 75.9±5.2* 66.9±6.2* 50.4±5.8*# 42.0±5.4*# 37.3±3.2*# 33.8±3.7*#2.55 μmol/L TanⅡA group 3 94.3±1.2 87.2±4.2* 70.6±6.1* 55.8±7.8* 41.3±5.4* 31.8±4.2* 26.6±3.8* 26.8±3.2*3.40 μmol/L TanⅡA group 3 92.1±0.9 85.1±4.5* 67.9±6.9* 50.7±6.3* 38.6±4.0* 29.7±3.9* 25.9±3.6* 24.6±3.3*0.10 μmol/L As2O3 group 3 93.0±1.4 90.3±4.3 81.2±6.7* 73.4±8.2*# 65.6±7.2*# 58.5±6.7*# 56.8±4.8*# 57.2±5.6*#1.00 μmol/L As2O3 group 3 93.7±0.8 86.6±4.1* 80.5±7.1* 71.1±9.5*# 64.4±7.1*# 60.2±7.7*# 57.7±4.3*# 56.5±6.4*#1.00 μmol/L ATRA group 3 89.5±2.1* 81.4±5.8*# 62.1±6.2*# 53.3±6.1* 39.0±5.2* 35.0±4.1* 24.2±3.3* 22.3±3.5*0.01% DMSO group 3 94.8±1.3 95.3±2.3 95.8±2.6 94.4±1.1 93.6±1.5 94.6±2.3 92.3±2.1 93.7±1.2

3 討 論

近年來，傳統中草藥 治療惡性腫瘤得到了越來越多學者的認可，現已證明中草藥在腫瘤的綜合治療中起重要作用［4］。丹參酮ⅡA是從活血化瘀中藥丹參中提取的有效成份，分子式為C19H1803，其結構中含有醌型結構，易被氧化還原，有多種生物學活性，可參與機體的多種生化反應，已在心血管、神經系統疾病領域得到廣泛應用，近年來發現其對白血病等腫瘤疾病具有抗腫瘤作用［5］。APL是急性髓細胞白血病的一種特殊類型，是最有希望治愈的急性白血病。APL具有特征性染色體異常t(15;17)(q22;q2l)，導致形成PML-RARα融合基因。PML-RARα融合基因轉錄、翻譯PML-RARα融合蛋白，PML-RARα融合蛋白通常與RXR或RARα形成多聚復合體，該復合體與RARα競爭RARE和RXR，抑制RARα的轉錄活性，阻斷粒細胞的分化成熟，導致APL發生。同時PML蛋白從核小體(NBs)中釋放出來，與PMLRARα融合蛋白形成二聚體，使NBs中PML蛋白減少，NBs的結構和功能破壞，免疫熒光染色表現為由大斑點型變為細小顆粒型。NBs為細胞核內一種多蛋白復合體，PML蛋白形成其外殼，在維持NBs正常結構中起核心作用［6］，PML發揮抑制生長和促進凋亡作用。PML蛋白和NBs相關蛋白的異位在APL發病中發揮重要作用。因此，恢復PML正常定位和正常NBs結構是APL新的治療策略。NB4細胞株來自一例第2次復發的APL女性患者，1991年建株。NB4細胞具有特征性的t( 15; 17)染色體移位，表達PML－RARα融合蛋白。在體外和動物模型中對誘導分化劑ATRA敏感，是研究APL分化作用機制的理想模型［7］。

表5 QT-PCR各組樣本CT值比較Tab.5 Effects of Tan ⅡA , ATRA and As203 on the Ct values of expressions of PML-RARα mRNA of NB4 cell lines(x±s, %)

表6 各組24 h PML-RARα融合蛋白融合蛋白表達的比較Tab.6 Effects of Tan ⅡA, ATRA and As2O3 on the PML/RARα fusion protein expression of NB4 cell lines for 24 h

在本實驗中，我們發現TanⅡA能明顯抑制NB4細胞生長。從形態學觀察，TanⅡA能促進NB4細胞分化。同時發現，NB4細胞在TanⅡA的作用下，在粒細胞早期表達的CD33表達逐漸減少，而在成熟粒細胞高表達的CDllb表達逐漸增多，從免疫表型上再一次證實了TanⅡA誘導NB4細胞分化的能力［8］。許多研究證實TanⅡA能誘導急性早幼粒細胞性白血病分化［5,9-10］，但其作用機制并不明確。

我們的研究證實，TanⅡA能恢復PML在NB4細胞核體定位。抗PML熒光單抗可很好地顯示PML在NB4細胞中的定位，TanⅡA作用前為散布于細胞內小斑點形的細顆粒，3種不同濃度的TanⅡA作用后12 h即可見粗顆粒狀PML小體，以后逐漸增加，到72 h NBs結構與數量即與正常的粒細胞無異。TanⅡA恢復核體結構的能力與其濃度有關，1.70 μmol/L TanⅡA的作用弱于其他兩劑量組，2.55和3.40 μmol/L TanⅡA組作用相似，顯示2.55 μmol/L為最適作用濃度。

通過實時定量PCR對不同濃度的TanⅡA處理后的NB4細胞進行動態觀察發現，12～168 h NB4細胞PML-RARα融合基因表達mRNA差異無統計學意義，證實TanⅡA對PML-RARα融合基因的表達無直接作用，不能影響PML-RA Rα融合蛋白的表達。

在實 驗中我們發現，TanⅡA處理NB4細胞1 2 h時，可見PML-RARα條帶灰度值下降，PML條帶顯現，表明TanⅡA能降解PMLRARα，使PML-RARα與復合物解離，解救RARα和PML，恢復PML功能，促進RARα的靶基因的激活，使細胞分化得以恢復。經過比較可見，TanⅡA降解PML-RARα作用有劑量依賴性，3種不同濃度TanⅡA組PML的條帶灰度值不同，2.55 μmol/L 和3.40 μmol/L TanⅡA組灰度值較高。

從以上實驗，我們可見TanⅡA具有誘導分化APL細胞的作用，我們也證實了TanⅡA是通過降解PML-RARα融合基因表達的蛋白而產生誘導分化作用的。那么TanⅡA是通過什么途徑降解PML-RARα融合蛋白的呢，我們可以從ATRA誘導分化和降解PML-RARα融合蛋白中得到某些啟示。ATRA是通過兩種途徑降解PML-RARα融合蛋白，即半胱天冬酶(caspases)途徑與泛素(ubiquitin)途徑。ATRA誘導Caspase-3樣活性，降解PML-RARα，切割位點位于螺旋盤狀結構的羧基端。前期的研究證實TanⅡA能激活caspase3［11］，由此我們可以推論：TanⅡA誘導APL分化是通過激活caspases降解PML-RARα融合蛋白，恢復NBs功能，解除PML-RARα對RAR a靶基因轉錄抑制而實現的。TanⅡA誘導APL凋亡是否存在泛素途徑作用，是否存在其他途徑，有待進一步探討。同時，我們也發現TanⅡA產生誘導分化作用的時間較ATRA長，這可能與ATRA作用的位點不同，也可能激活的信號傳導途徑不同，也可能導致基因表達調控網絡的變化不同，這有待我們進一步探討研究。

［參 考 文 獻］

［1］ KASTNER P, LAWRENCE H J, WALTZINGER C, et al.Positive and negative regulation of granulopoiesis by endogenous RARalpha［J］.Blood, 2001, 97(5): 1314-1320.

［2］ GABERT J, BEILLARD E, VAN DER VELDEN V H, et al.Standardization and quality control studies of 'real-time'quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia-a Europe Against Cancer program［J］.Leukemia,2003, 17(12): 2318-2357.

［3］ VILLAMOR N, COSTA D, AYMERICH M, et al.Rapid diagnosis of acute promyelocytic leukemia by analyzing the immunocytochemical pattern of the PML protein with the monoclonal antibody PG-M3［J］.Am J Clin Pathol, 2000,114(5): 786-792.

［4］ TREASURE J.Herbal medicine and cancer: an introductory overview［J］.Semin Oncol Nurs, 2005, 21(3): 177-183.

［5］ LIU J J, ZHANG Y, LIN D J, et al.Tanshinone ⅡA inhibits leukemia THP-1 cell growth by induction of apoptosis［J］.Oncol Rep, 2009, 21(4): 1075-1081.

［6］ ZHU J, ZHOU J, PERES L, et al.A sumoylation site in PML/RARα is essential for leukemic transformation［J］.Cancer Cell, 2005, 7(2): 143-153.

［7］ LANOTTE M, MARTIN-THOUVENIN V, NAJMAN S, et al.NB4, a maturation inducible cell line with t(15;17) marker isolated from a human acute promyelocytic leukemia (M3)［J］.Blood, 1991, 77(5): 1080-1086.

［8］ TAN S M, HYLAND R H, Al-SHAMKHANI A, et al.Effect of integrin beta 2 subunit truncations on LFA-1 (CD11a/CD18)and Mac-1 (CD11b/CD18) assembly, surface expression, and function［J］.J Immunol, 2000, 165(5): 2574-2581.

［9］ YANG L, GONG Y P, YANG Y M, et al.A successful case of tanshinone Ⅱ A treatment for relapsed acute promyelocytic leukemia after maintainance therapy of all-trans retinoic acid and arsenic trioxide［J］.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 2010, 41(6): 1065-1067.

［10］ ZHANG K, LI J, MENG W, et al.C/EBPbeta and CHOP participate in tanshinone ⅡA-induced differentiation and apoptosis of acute promyelocytic leukemia cells in vitro［J］.Int J Hematol, 2010, 92(4): 571-578.

［11］ 羊裔明, 粱效功, 鄧承祺, 等.丹參酮ⅡA誘導NB4細胞凋亡時Caspase3的活性變化［J］.四川大學學報, 2003, 34(3):549-551.