rAd-p53瘤內注射聯合放化療前后鼻咽癌原發灶細胞凋亡的變化

蘭桂萍 司勇鋒 韋海明 何寧 覃揚達 黃波 何承誠

鼻咽癌是我國常見的頭頸部鱗癌。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，但中晚期鼻咽癌因腫瘤負荷大，治療后局部復發和遠處轉移率高。rAd-p53是通過腺病毒載體將野生型p53基因轉導入腫瘤細胞發揮治療效應[1]，可協同放化療發揮作用。為了解rAd-p53聯合放化療治療中晚期鼻咽癌的治療效果，本文主要對治療前后的鼻咽部腫瘤組織標本進行細胞凋亡原位檢測（TUNEL法）。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 本組61名病例源于廣西壯族自治區人民醫院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科在2007年01月～2010年06月收治的部分鼻咽癌患者，男50例，女11例，年齡在22～63歲之間，中位年齡42歲。全部病例經病理診斷為未分化非角化性癌，均行鼻咽顱底CT（或MRI）、B超、X線及鼻內鏡檢查了解病變范圍；按UICC（1997）鼻咽癌分期方案分期的Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者；年齡在20～65歲之間；卡氏評分≥70分；簽署知情同意書。全部病例隨機分為2組，治療組：rAd-p53瘤內注射+同步放化療，對照組：同步放化療。兩組病例之間年齡、性別、臨床分期、T分期、N分期間差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 放射治療：采用西門子Primus全數字化直線加速器常規體外照射，采用面頸聯合野照射36Gy后縮野，采用耳前野輔以鼻前野，原發灶70～76Gy/35f/7～8w，頸轉移灶60～70Gy。

化學藥物治療：卡鉑+5-Fu方案。劑量按體表面積計算，卡鉑500mg·（m2·d）-1，d1靜脈點滴，5-Fu 500mg·（m2·d）-1，d1-5，24小時微泵持續輸入，與放療同步進行，21天后重復化療1次，共2個周期。

rAd-p53瘤內注射：重組人p53腺病毒注射液（rAd-p53,中國深圳賽百諾公司生產）劑量：1×1012VP/支，1次/周，治療6～8周；用法：用生理鹽水稀釋rAd-p53到2ml后使用，在鼻內鏡直視下分3點注入鼻咽部原發灶內；用藥時間：于放療前48～72小時行瘤內注射。

1.2.2 鼻咽癌原發灶標本采取及處理 分別于治療前及放療至20Gy（第3次rAd-p53瘤內注射后）獲取活體組織標本。用1%麻黃素液和1%的卡因液棉片行鼻腔、鼻咽部粘膜麻醉，在鼻內鏡直視下于鼻咽部瘤體處應用活檢鉗獲取活體組織標本。全部標本經10%甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋。TUNEL凋亡試劑盒購于美國羅氏公司，DAB顯色試劑盒購于北京中杉生物技術公司。TUNEL染色：常規脫蠟脫水，過氧化氫封閉后，微波處理230分鐘。TDT酶、biodUTP37℃孵育1h。生物素標記-HRP37℃孵育1h。DAB顯色、樹封、脫水、封片。用已知的陽性對照片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 觀察指標 凋亡指數：細胞核染成棕褐色為凋亡細胞，隨機選取腫瘤區域，在高倍鏡（40×10）下，計數1000個腫瘤細胞中的陽性細胞數，計算出凋亡指數（AI）（AI=凋亡細胞數/腫瘤細胞數×100%）。隨訪時間是2007年01月～2011年01月，隨訪方式是患者定期回院復查和專職隨訪員電話隨訪。

1.3 統計學方法 所有分析均使用SPSS13.0統計學軟件進行，計量資料以(±s)表示，組間采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

治療前后的細胞凋亡指數（AI）的變化 對照組治療前后的AI分別為（4.455±1.670）%、（8.252±4.076）%，治療組治療前后的AI分別為（4.453±1.670）%、（13.370±6.957）%，治療組治療前后、對照組治療前后、治療組與對照組治療后AI有統計學差異（P＜0.05）。（見表1）。

表1 兩組患者治療前后鼻咽癌原發灶細胞凋亡指數對比情況

3 討論

目前放化療成為中晚期鼻咽癌的主要治療手段。但因中晚期鼻咽癌腫瘤較大，其中不乏大量的乏氧細胞，對放化療并不敏感，而我們將rAd-p53聯合同步放化療應用于治療中晚期鼻咽癌患者卻獲得了較好的臨床效果[2]。

細胞凋亡是一種具有特定形態和生化改變的細胞死亡過程。p53基因的產物p53蛋白的主要功能是維護細胞基因組的穩定，在參與細胞周期調節，誘導細胞凋亡的過程發揮著關鍵性的作用。當細胞DNA出現損傷時，p53蛋白活化，可以阻滯細胞周期，修復細胞DNA；當細胞DNA損傷無法修復的時候，p53蛋白可以上調促凋亡基因，下調抗凋亡基因，進而啟動細胞凋亡程序，誘導細胞凋亡[3]；p53蛋白還可以直接刺激Bax蛋白或者caspase-8，不經轉錄調控途徑直接啟動細胞凋亡程序。放療和化療對腫瘤細胞的殺傷效應主要依賴p53基因途徑引發的細胞凋亡實現的[4]。rAd—p53不僅具有獨立的抑制多種腫瘤生長的作用，還可以通過激活bax基因、抑制bcl—x基因以及誘導前凋亡基因puma、bak、fas的表達，促進細胞凋亡，提高多種腫瘤細胞對化、放療的敏感性[5]。

我們的研究發現對照組同步放化療，細胞凋亡指數明顯增高，治療前后有統計學差異，說明放化療后具有誘導細胞凋亡的作用；但治療組治療前后細胞凋亡指數增高更明顯，而且治療組與對照組治療后的細胞凋亡指數比較具有顯著性的統計學差異，說明導入腫瘤細胞內的rAd-p53基因與放化療一樣發揮了誘導細胞凋亡的作用，而且與放化療具有協同治療作用。而我們的臨床研究也證實[6]，rAd-p53瘤內注射聯合同步放化療治療中晚期鼻咽癌患者可獲得更好的腫瘤完全緩解率。Pan等[7]應用rAd-p53聯合放療治療鼻咽癌病人的6年隨訪資料顯示rAd-p53可以更好控制鼻咽癌的發展和提高生存率。可見rAd-p53瘤內注射聯合同步放化療治療中晚期鼻咽癌可以取得更好的治療效果。

[1]張珊文.中國p53基因治療的現狀和前景[J].醫學研究雜志，2008，37（6）：3-5.

[2]司勇鋒,何承誠,蘭桂萍.重組人p53腺病毒注射液聯合放化療對中晚期鼻咽癌消退率的影響[J].中國腫瘤臨床，2009，36（18）：1031-1033.

[3]Smith ND,Rubenstein JN,Eggener SE,et al.The p53 tumor suppressor gene and nuclear protein:basic science review and relevance in the management of bladder cancer[J]. J Urol,2003,169(4):1219-1228.

[4]Dey A,Verma CS,Lane DP.Updates on p53:modulation of p53 degradation as a therapertic approch[J].Br J Cancer,2008,98(1):4-8.

[5]張躍偉，娜仁圖戈，李闖，等.內鏡下rAd—p53注射聯合動脈灌注治療進展期胃癌[J].當代醫學,2010,16(11):171-172.

[6]蘭桂萍，蘇紀平，司勇鋒，等.重組人p53腺病毒聯合放化療治療中晚期鼻咽癌的臨床觀察[J].實用醫學雜志，2011，27（13）：2341-2344.

[7]Pan JJ,Zhang SW,Chen CB,et al.Effect of recombinant Adenovirus-p53 Combined With Radiotherapy on Long-Time Prognosis of Advanced Nasopharyngeal Carcinoma[J].J Chin Oncol,2009,27(5)：799-804.