鮑林對于血紅蛋白分子學領域的貢獻

張宏志 李建

(1玉林師范學院 廣西玉林 537000；2湖南省邵東縣人民醫院 湖南邵東 422802)

萊納斯·鮑林(Linus Pauling，1901～1994)被認為是“第一位真正的分子生物學家”，他開拓了眾多生物分子學新領域，包括抗體的分子機制、分子醫學、分子精神病學、分子進化生物學等；他還提出了蛋白質的α螺旋結構，在DNA結構準確測定10多年以前，就準確地預言了其結構特征。加州理工學院的B. Kamb曾經評價：“鮑林的知識、創造力、開拓性沒有哪里比分子生物學領域表現得更明顯。他被看成是最偉大的化學家之一，也是第一位真正的分子生物學家。在這個領域，他的天才在于他具有認識復雜生物現象的分子基礎的能力”[1]。筆者查閱相關資料，認為血紅蛋白研究領域很能體現這位偉大化學家敏銳的“分子學”視角和卓越的科學創造力，所以在此對鮑林的血紅蛋白分子學貢獻進行介紹。

1 血紅蛋白的分子結構

利用磁性實驗研究血紅蛋白(hemoglobin)的結構特征，是鮑林和科里爾(C.D.Coryell)在20世紀30年代主要開展的工作；從1935年在ProceedingsofNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica上發表題為《血紅蛋白的氧結合平衡和結構解釋》的論文起，鮑林在這一領域相繼發表了20余篇論文。

1.1 血紅素中鐵的成鍵特征

血紅蛋白分子由2條α鏈和2條β鏈組成，每條α鏈和β鏈都包含1個血紅素。為了弄清血紅素中鐵的成鍵情況，鮑林提出了通過測量物質磁性推測其結構特征的方法。鮑林和科里爾一起先后成功地測定了亞鐵血紅素、鐵血紅素、珠蛋白血色素等物質的磁性，并且計算出化合物中金屬中心的未成對電子數。

1936年，鮑林和科里爾報道了血色素及其衍生物的磁性特征和結構。鮑林認為，亞鐵血紅素及鐵血紅素的未成對電子數分別為4個和5個，與Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)的未成對電子數相同；磁性實驗數據與形成4個dsp2共價鍵的說法不符，從而證實了在亞鐵血紅素及鐵血紅素中，Fe同相鄰的卟啉N原子之間以離子鍵而不是以共價鍵的形式存在[2]。

鮑林在同一論文中還根據珠蛋白血色素、吡啶血色素、煙堿血色素、二腈血色素的未成對電子數為0的事實推測，在這些物質中，Fe(Ⅱ)可能是以d2sp3構型與其他原子形成共價鍵，Fe(Ⅱ)的2個3d軌道參與形成共價鍵；Fe(Ⅱ)同4個卟啉N原子及2個其他原子以八面體構型結合[2]。

1.2 氧分子與血紅蛋白的結合

氧分子與血紅蛋白如何結合的問題曾長期懸而未決。當時存在兩種相反的觀點，一種觀點認為，氧非專一地吸附于血紅蛋白的表面，以范德華力與血紅蛋白結合；另一種觀點認為，氧并不是非專一地吸附于血紅蛋白表面，而是以特定的化學鍵與血紅蛋白結合。為了解決這一爭端，鮑林提出通過測量氧合血紅蛋白的磁性作出判斷，因為氧分子帶有2個未成對電子而具有很大的磁矩。假設氧與血紅蛋白以范德華力結合，那么未成對電子數將不會改變；而若氧與血紅蛋白以化學鍵結合，則未成對電子數將發生變化[1]。鮑林通過測量發現，氧合血紅蛋白的未成對電子數為0，而氧分子、脫氧血紅蛋白的未成對電子數分別為2和16，說明當氧分子與血紅蛋白結合時，電子結構發生了很大的變化[3]；磁性實驗的結果否定了氧分子是以范德華力吸附于血紅蛋白表面的觀點。

1.3 一氧化碳血紅蛋白的分子結構

通過測量一氧化碳血紅蛋白的磁性，鮑林發現它的未成對電子數為0，由此，他推測一氧化碳血紅蛋白中的Fe(Ⅱ)也可能是以共價鍵與其他原子結合，即以d2sp3軌道形成八面體構型。在圖1所示Fe(Ⅱ)的6個d2sp3軌道中，分別有4個與卟啉N原子、1個與珠蛋白原子(可能是N原子)、1個與C原子形成共價鍵。

根據1935年L.O.Brockway和P.C.Cross的報道，鎳羰基化合物中的Ni-C鍵具有雙鍵特征。據此，鮑林進一步提出了一氧化碳血紅蛋白可能的兩種共振結構(圖2)[3]。

圖1 一氧化碳血紅蛋白的結構

圖2 一氧化碳血紅蛋白的兩種可能結構

同樣，與磁性數據相符的氧合血紅蛋白可能的共振結構如圖3所示[3]。

圖3 氧合血紅蛋白的兩種可能結構

1936年，鮑林和科里爾報道了氧合血紅蛋白和一氧化碳血紅蛋白的磁性特征及其結構。鮑林指出，在結合氧分子或一氧化碳分子時，血紅蛋白分子結構發生了巨大的變化；血紅蛋白與鐵形成的鍵是離子鍵；而氧合血紅蛋白和一氧化碳血紅蛋白分子沒有未成對電子，血紅蛋白與鐵形成的鍵是共價鍵，這種鍵型的變化目前只在血紅蛋白的衍生物中被觀察到[3-4]。

在鮑林研究的基礎上，英國化學家馬克斯·佩魯茲發現，脫氧血紅蛋白的Fe(Ⅱ)處于高自旋態，其離子半徑為78pm；而氧合血紅蛋白的Fe(Ⅱ)處于低自旋態，其離子半徑為61pm。在脫氧血紅蛋白分子中，Fe(Ⅱ)處于卟啉環平面上方約80pm處，當Fe(Ⅱ)結合O2時，其離子半徑縮小了17pm，使Fe(Ⅱ)從卟啉環的上方落入環的平面內，從而為氧與血紅蛋白的進一步結合創造了有利的立體化學條件[5]。

2 鐮刀型細胞血紅蛋白與分子病

利用電泳實驗研究鐮刀型細胞血紅蛋白是鮑林和哈維·伊泰諾(H.A.Itano)在20世紀40年代末到50年代主要從事的研究工作之一；從1949年鮑林和伊泰諾在JournalofHematology發表題為《鐮刀型細胞貧血癥的快速診斷》的論文起，鮑林等人相繼發表了15篇有關的論文。

2.1 鐮刀型細胞血紅蛋白的電泳速度

鐮刀型細胞貧血癥(sickle cell anemia)是一種遺傳性疾病，主要在非洲黑色人群中發生。1910年，美國醫生J.B.Herrick發現，鐮刀型細胞貧血癥患者的紅血球在靜脈循環和動脈循環中發生周期性的變化。病人的紅血球在動脈血中是正常的圓盤狀，而在靜脈血中卻是異常的鐮刀狀。

人們一般認為，鐮刀型細胞貧血癥僅僅是一種紅細胞變形而引起的典型細胞型疾病(a classic disease of cells)；鮑林卻認為，鐮刀狀化只發生在靜脈循環中而不發生在動脈循環中，強烈地暗示了鐮刀型細胞貧血癥是一種血紅蛋白分子的疾病；周期性的變化可能與血紅蛋白在靜脈循環中以脫氧血紅蛋白形式而在動脈循環中卻以氧合血紅蛋白的形式存在有關[1]。另外，在O2不出現的情況下，鐮刀型細胞貧血癥患者的血液用CO飽和后也不會發生鐮刀狀化，說明了鐮刀狀化可能與血紅蛋白分子有關；CO與O2分別能與血紅蛋白結合成性質相似的一氧化碳血紅蛋白或氧合血紅蛋白[1]，從而可防止血紅蛋白細胞的鐮刀狀化。

根據上述推測，鮑林做了3種類型鐮刀型細胞血紅蛋白(HbS)和正常血紅蛋白(HbA)的對比實驗：① 一氧化碳血紅蛋白溶液；② 亞鐵血紅蛋白溶液(加入連二亞硫酸鈉)；③ 一氧化碳血紅蛋白溶液(加入連二亞硫酸鈉)。其中在第②類實驗中加入連二亞硫酸鈉的目的是防止亞鐵血紅蛋白被氧化為鐵血紅蛋白；第①、③類實驗的差異僅僅在于是否加入連二亞硫酸鈉，目的在于檢驗連二亞硫酸鈉本身是否對電泳有影響[6]。

哈維·伊泰諾是一位醫學博士，1945年在圣路易斯大學獲得博士學位；1946年9月，經導師E. A.Doisy教授推薦來到帕薩迪那跟隨鮑林進行鐮刀型細胞血紅蛋白研究。鮑林和伊泰諾發現，鐮刀型細胞血紅蛋白在電場中的移動速度比正常血紅蛋白快；在磷酸鹽緩沖溶液中，鐮刀型細胞一氧化碳血紅蛋白的移動速度為2.63×10-5cm/s，而正常一氧化碳血紅蛋白的移動速度為2.23×10-5cm/s[6]，即移動速度存在0.40×10-5cm/s的差異。鐮刀型細胞血紅蛋白與正常血紅蛋白所帶的電荷也是不同的，前者在電場中向負極移動，后者在電場中向正極移動，說明鐮刀型細胞血紅蛋白和正常血紅蛋白分別帶正電荷和負電荷。

2.2 鐮刀型細胞血紅蛋白的等電點

鮑林和伊泰諾進一步比較了鐮刀型細胞血紅蛋白和正常血紅蛋白的等電點(表1)。

他們發現，正常人一氧化碳血紅蛋白的酸堿滴定曲線在等電點附近是線性的，等電點1個pH單位的變化相應于血紅蛋白分子13個電荷變化，這個結果與1937年B.German對馬氧合血紅蛋白實驗得到的結果一致。

正常脫氧血紅蛋白與鐮刀型細胞脫氧血紅蛋白等電點的差值為0.23，正常一氧化碳血紅蛋白與鐮刀型細胞一氧化碳血紅蛋白等電點的差值為0.22，可以計算出，鐮刀型細胞血紅蛋白與正常血紅蛋白之間有3個電荷的差異；考慮到可能的實驗誤差，鮑林和伊泰諾得出結論，每個鐮刀型細胞血紅蛋白分子比正常血紅蛋白分子具有額外的2～4個正電荷[6]。

表1 磷酸緩沖溶液中的等電點(μ=0.1)

2.3 鐮刀型細胞血紅蛋白的電泳圖譜

鮑林和伊泰諾還比較了4種血紅蛋白溶液的電泳圖譜(圖4)。

圖4 4種不同類型血紅蛋白的電泳圖譜磷酸鹽緩沖溶液中(pH=6.90)：(a) 正常血紅蛋白，單峰；(b) 鐮刀型細胞貧血癥血紅蛋白，單峰；(c) 鐮刀型細胞貧血癥攜帶者血紅蛋白，雙峰；(d) 鐮刀型細胞貧血癥血紅蛋白與正常血紅蛋白各50%，雙峰

鐮刀型細胞貧血癥攜帶者是正常與鐮刀型細胞貧血癥的中間階段，癥狀比鐮刀型細胞貧血癥輕。實驗顯示，鐮刀型細胞貧血癥攜帶者的血紅蛋白是正常血紅蛋白和鐮刀型細胞血紅蛋白的混合體，大約各占50%。鮑林推測，鐮刀型細胞貧血癥患者的基因是一種純合體(homozygous condition)，有兩條帶病的等位基因；而攜帶者的基因是一種雜合體(heterozygous condition)，只有一條帶病的等位基因[7]。

1949年11月，鮑林和伊泰諾在Science上發表了題為《鐮刀型細胞貧血癥——一種分子病》的論文[6]，詳細報道了鐮刀型細胞血紅蛋白與正常血紅蛋白的差異，并且討論了鐮刀型細胞血紅蛋白結晶的原因、遺傳機制等問題。

鮑林對鐮刀型細胞血紅蛋白的研究第一次展示了這種疾病的分子基礎，第一次提出分子病的概念，吸引了醫學科研人員從分子層次上進行疾病研究。1956年，英國科學家V.M.Ingram聯合使用電泳和紙層析技術對鐮刀型細胞血紅蛋白進行研究，發現了鐮刀型細胞血紅蛋白的單氨基酸替換現象：正常血紅蛋白β鏈的第6位置是谷氨酸，而鐮刀型細胞血紅蛋白β鏈的第6位置卻變成了纈氨酸；谷氨酸帶一個單位的負電荷，纈氨酸不帶電荷，這就進一步解釋了鮑林和伊泰諾發現的鐮刀型細胞血紅蛋白與正常血紅蛋白的帶電荷數及電泳速度的差異。

3 血紅蛋白氨基酸序列與分子鐘

對血紅蛋白氨基酸序列與生物進化問題的探討是鮑林和埃米爾·朱克坎德爾(E.Zuckerkandl)在20世紀60年代的主要研究領域。從1959年鮑林在ChemicalandEngineeringNews發表題為《分子和進化》的論文起，鮑林和朱克坎德爾一共發表了8篇論文。

3.1 指紋圖譜與物種的親緣關系

聯合使用電泳和紙層析技術，鮑林比較了3種類型的指紋圖譜：

① 一個物種在不同階段的指紋圖譜。例如，成年人與胎兒的指紋圖譜比較。

② 不同物種在一定時期的指紋圖譜。例如，人與黑猩猩、大猩猩、猩猩和羅猴的指紋圖譜比較；人與牛、馬、豬的指紋圖譜比較；人與硬骨魚、肺魚和鯊魚的指紋圖譜比較。

③ 一個物種在不同時期的指紋圖譜[8]。

從①的比較中發現，成年人的指紋圖譜與人的胎兒的指紋圖譜相差很大，而成年人的指紋圖譜與成年馬的指紋圖譜卻比較相似；鮑林推測，對環境的適應性因素可能是造成這種現象的重要原因[8]。從②的比較中發現，靈長類動物的指紋圖譜與人的指紋圖譜十分相似，牛和豬的指紋圖譜與人的指紋圖譜相差較大，而魚的指紋圖譜與人的指紋圖譜相差更大；從豬、牛、人指紋圖譜的兩兩相互比較中，鮑林發現豬、牛與人的變化往往出現在相同的部位；鮑林推測，可能在血紅蛋白分子中存在著容易突變的區域，或者這些區域的突變更易于被自然選擇保存下來[8]。

鮑林還根據人與靈長類動物指紋圖譜的相似性，對正常基因和突變基因的穩定性進行了推測。鮑林認為：人的血紅蛋白與靈長類動物的血紅蛋白相比沒有大的變化，反映了血紅蛋白α、β鏈的正常基因與突變基因相比具有更大的穩定性，突變基因往往會回復突變(back-mutation)回到正常基因；除了自然選擇因素之外，基因本身的熱力學穩定性也可能是決定等位基因分布的重要因素[8]。

3.2 分子鐘與物種分歧的時間

根據人與馬血紅蛋白氨基酸數目的差異以及古生物學證據，鮑林和朱克坎德爾還推斷出每個有效突變的時間。人與馬血紅蛋白的α鏈大約有150個氨基酸，每條α鏈上具有9個有效的突變。由于人與馬是在大約1.3×108年前分歧的，據此可以計算出每個有效突變的時間約為1.45×107年[1]。

1962年，在論文《分子病、進化與基因的異質性》中，鮑林和朱克坎德爾進一步推斷出物種分歧的時間和相應的地質時期[1]。在表2中，δ鏈和γ鏈的氨基酸數目的差異為36個，物種分歧的時間為260百萬年前的石炭紀前期；α鏈和β鏈的氨基酸數目差異更大，其祖先序列出現在565百萬年前的石炭紀末期。

表2 血紅蛋白鏈與物種分歧的時間

1964年9月17日，由V.Bryson和H.Vogel組織的“進化的基因和蛋白質”學術會議在美國羅格斯大學的微生物研究所舉行，朱克坎德爾正式提出了分子鐘的概念。羅格斯會議被認為是現代分子進化生物學的標志[7]。在羅格斯會議之后，人們就分子學與形態學方法的優劣、分子的異速進化進行了熱烈的討論，這些討論促進了生物學家、分子生物學家、進化論者以及遺傳學家之間的交流。

3.3 已滅絕生物的分子復原

1963年，鮑林和朱克坎德爾提出了重建滅絕生物氨基酸序列的方法[9]。鮑林指出，如果兩條同源多肽鏈上指定分子部位的氨基酸殘基是一樣的，那么就有一定的把握認為這個氨基酸殘基在它們祖先序列上也同樣存在；如果在3條同源多肽鏈中的兩條鏈上出現同一個氨基酸殘基，而在另一條鏈上不出現，那么可以推斷，是生物進化中的突變導致了這種差異[9]。

分子復原研究的重要意義在于，可以獲得古代生物功能、生物環境的信息，獲得高于分子水平的認識。鮑林認為，根據現存物種相關多肽鏈的古生物化學研究，可以推測滅絕生物基因的組成；如果合成這些滅絕生物的組成部分，不僅可以研究它們的物理化學特性，還可以推測它們的生物功能。例如，血紅蛋白對氧的親和性、對pH的依賴性以及祖先酶對底物的親和性等。當滅絕生物的古基因信息積累得足夠多時，做出有機體整體的推斷將變得可能[9]。

鮑林和朱克坎德爾的分子進化生物學研究，開創了探討物種親緣關系、物種分歧時間、滅絕生物的新途徑，將“古生物學、進化生物學和分子生物學等領域統一起來了”[10]。G.T.Morgan指出，20世紀60年代見證了分子進化生物學的誕生，鮑林與朱克坎德爾奠定了這個新學科的基礎[7]。

4 結語

鮑林對于血紅蛋白分子學領域的貢獻，開創了分子醫學和分子進化生物學的新領域，對后續研究產生了重要的影響。以分子鐘為例，幾十年來，科學家相繼在分子鐘理論、分子鐘應用、寬松分子鐘方法等方面取得了重要的進展。

1963年，E.Margoliash在研究細胞色素C時發現，馬和豬、金槍魚、酵母的氨基酸數目差異分別為3、19、44，顯示了親緣關系和遺傳距離之間的聯系[11]；1968年，M.Kimura在Nature上發表了題為《分子水平上的進化速率》的論文，提出遺傳漂移和中性理論，為分子鐘奠定了理論基礎。

20世紀80年代，測序技術的發展促進了DNA分子鐘的研究。1980年，T.Miyata對人、鼠、兔的研究發現，各種哺乳動物DNA的進化速率幾乎一樣；1986年，R.J.Britten的研究卻發現，人與嚙齒動物DNA的進化速率存在著明顯差異[12]；1993年，DNA進化速率與機體大小的關系引起了人們的注意，雖然一般認為有機體的大小并不直接影響分子進化的速率，但大的有機體往往具有長生命周期和慢代謝速率；1994年，D.M.Rand發現，這些差異可能通過某種方式影響mtDNA的突變率[12]。

在應用方面，分子鐘已經應用于前寒武紀生物大爆發、被子植物的起源、人類的起源等許多領域。前寒武紀是地球生命演化的重要時期，但前寒武紀生物大多是軟體類生物，化石記錄貧乏，而分子鐘為前寒武紀生物研究開辟了新的途徑。1996年，R.F.Doolittle對57種酶蛋白的531個氨基酸序列進行分析，所得到的系統樹與16rRNA系統樹在分枝的長度和順序上非常吻合。通過這項研究，R.F.Doolittle認為原核生物和真核生物的分支時間約為20億年，為植物和動物分支時間的兩倍。1996年，G.A.Wray對后生動物門類的分子鐘研究表明，原口動物和后口動物在12億年前分支，并得出了在前寒武紀已經出現后生動物的結論[13]。

在人類的起源方面，1986年，牛津大學的科學家從對現代8個種群的700個個體的β胡蘿卜素基因的研究得出結論，人類祖先來源于非洲并不斷向外遷移；1987年，R.L.Cann等對5個地理區域的147個人的胎盤提取mtDNA的研究表明，所有這些mtDNA主干都來自20萬年前的非洲祖先[14]。

在分子的異速進化方面，科學家也進行了多方面探討，發展出了目前的寬松分子鐘方法，包括相對速率檢驗法、局域分子鐘法、貝葉斯計算法等。這些探討大大深化了分子鐘研究，取得了許多重要的成果。

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