陜北棗ISSR反應體系的建立及其優化

王延峰，史妮妮，李永鑫，葉 飛，賀曉龍，陳國梁

（1.延安大學生命科學學院，陜西 延安 716000；2.陜西省區域生物資源保育與利用工程技術研究中心，陜西 延安 716000）

中國是棗類遺傳變異和起源較早的中心地區之一。棗也是陜北地區重要的經濟植物之一，隨著西部大開發以及退耕還林的實施，棗業經濟得到迅猛發展，在陜北黃河沿岸諸縣脫貧致富中發揮著越來越重要的作用。由于棗樹的單胚性特點，在復雜的生態環境下，形成了極其豐富的遺傳多樣性，這也就導致了至今為止人們對于該種質資源的演化關系及其種間關系不甚清楚，給棗的優質種質資源的保護帶來了不便。前人對棗品種的分類從形態學、細胞核型分析、同工酶生化標記等方面做了大量的研究[1]，但都因其工作過程繁瑣、費時，以及受敏感的生態環境和其有限的標記數量與因素的影響，使棗樹的遺傳多樣性研究一直受到限制，這也就使得人們將研究的方向轉到了分子生物學方面。近幾年，相繼出現了許多DNA 分子標記技術，如SSR（simple sequence repeats，簡單重復序列）、簡單序列重復區間擴增多態性（inter-simple sequence repeats，ISSR）、RFLP （restriction fragment length polymorphism，限制性內切酶片段長度多態性）、AFLP（amplified fragment length polymorphism 擴增片段長度多態性）、RAPD（random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA）等[2-3]。其中ISSR（inter simple sequence repeat）標記是基于微衛星序列發展起來的一項技術[4]，它是根據植物廣泛存在簡單重復序列的特點，并利用在植物基因組中常常出現的簡單重復序列本身設計引物，無需預先克隆和測序。ISSR 標記通常為顯性標記，呈孟德爾式遺傳，具有很好的穩定性和多態性，已在果樹遺傳學如品種鑒定、親緣關系分析、遺傳多樣性分析以及遺傳圖譜的構建等方面得到廣泛應用[5-12]。為了更好地對陜北棗類種質資源收集保存、分類鑒定，筆者選用陜北地區的11 種棗樹品種，對最適ISSR-PCR 反應體系的建立進行了研究，以期為利用ISSR 標記技術分析各品種間的親緣關系奠定實驗技術基礎，為陜北棗品種的合理開發利用與選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

以陜北地方品種棗樹葉片為材料，供試品種有11 個，其中駿棗、脆棗、大團棗、棗梨棗、木棗、灰條棗、贊皇大棗、狗頭棗、葫蘆棗采自延川縣，團圓棗采自清澗縣，晉棗采自佳縣。采樣時均采取幼葉，用冰盒保存后立即帶回實驗室，洗凈、晾干后于－70℃冰箱中保存備用。

所用引物參照劉興菊等[7]篩選出的10 條引物，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。Taq DNA聚合酶及dNTP 購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 的提取 采用改良CTAB 方法進行棗葉片的基因組DNA 提取。獲得的DNA 經0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測合格后，將樣品濃度調至50 ng/μL 保存備用。

1.2.2 ISSR 體系的優化 PCR 基本反應體系：1×PCR buffer，12.9 μL Easy PCR ystem，0.3 μmol/L 引物，1.5 U Taq DNA 聚合酶，DNA 模板50 ng。PCR反應的優化包括反應體系各成分的含量和退火溫度的優化。以狗頭棗的DNA 為模板，選用引物S46（序列為（CA）8G），其中引物濃度設0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L 5 個濃度梯度；酶用量設0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 U 5 個梯度；退火溫度設置在46～60℃范圍內，梯度溫度由美國THERMO 梯度PCR 儀自動生成，采取3 次重復。

1.2.3 11 個棗樹品種間DNA 擴增 采用優化的ISSR 體系（25 μL）：1×PCR buffer，12.9 μL Easy PCR ystem，0.4 μmol/L 引物S46，DNA 模板50 ng，1.5 U TaqDNA 聚合酶，以及優化后的PCR 程序：95℃預變性5 min；95℃變性50 s，54.8℃退火50 s，72℃延伸5 min，共35 個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。在美國THERMO 梯度PCR 儀上進行擴增，然后取PCR 產物5 μL 進行點樣，1.0%的瓊脂糖（EB）凝膠電泳，在UVP 凝膠成像系統下成像保存。以Tiangenr MarkerⅢ產生的帶為標準參照。

2 結果與分析

2.1 ISSR體系的優化

2.1.1 引物對PCR 擴增的影響 從圖1 可以看出，在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L 引物濃度下，都能擴增出目標條帶。隨著引物濃度的升高，擴增條帶由弱到強，帶型彌散程度逐漸減輕，非特異性擴增條帶逐漸減少。引物濃度為0.1～0.3 μmol/L 時得到的PCR 產物主帶弱，非特異性擴增條帶較多。當引物濃度為0.4～0.5 μmol/L 時，PCR 反應穩定，條帶清晰，非特異性擴增條帶少。考慮節約試劑，試驗合適的引物濃度為0.4 μmol/L。

圖1 不同引物濃度擴增的ISSR 帶型

2.1.2 Taq 酶濃度對PCR 擴增的影響 結果如圖2 所示，25 μL 反應體系中Taq 酶用量為0.25 U 和0.5 U 時，帶型較模糊甚至某些條帶也會不出現；Taq 酶用量為1.0 U 時，條帶亮度較大，但出現了較多非特異性條帶或拖帶現象；Taq 酶用量>1.0 U時，目標條帶帶型和強度較好。這說明在一定范圍內，隨著酶量的微量增加，目標條帶亮度隨之增加。因此，在保證試驗結果準確性的前提下，考慮節省試劑，建議Taq 酶用量為1.5 U 。

圖2 不同Taq 酶濃度擴增的ISSR 帶型

2.1.3 退火溫度對PCR 擴增的影響 以駿棗棗樹幼葉為材料，退火溫度設定為12 個梯度，分別是46.1、46.5、47.4、48.6、50.2、52.1、54.8、56.7、58.4、59.8、60.9、61.3℃。經過電泳檢測發現隨著退火溫度的提高，條帶逐漸清晰增多。為了使電泳圖譜更加有對比度，從擴增的12 個梯度中選用了7 個梯度（61.3、60.9、58.4、56.7、54.8、52.1、48.6℃）進行電泳，結果如圖3 所示，當退火溫度<54.8℃時，條帶弱少；當退火溫度>54.8℃時，主條帶減弱，非特異性條帶增多，且拖帶趨于嚴重。不同引物的退火溫度有一定的差異，這與其堿基組成不同有直接的關系。有的引物在退火溫度為43℃時，便能擴增出產物，而有的引物退火溫度達到55℃。由此看來，引物不同其退火溫度的上下限度有所不同，只有在一定溫度范圍內提高退火溫度才可以增加擴增產物的特異性，但溫度升高到一定值時，條帶便減弱、減少。試驗結果顯示，退火溫度為52.1、54.8、56.7℃時，擴增特異性表現較好，相比而言退火溫度為54.8℃時，主帶清晰而副帶少且無彌散，因此，引物S46 最適合的退火溫度為54.8℃。

圖3 不同退火溫度下的ISSR 帶型

2.2 棗樹品種的擴增結果

利用優化后的ISSR 反應體系和程序篩選出的引物序列S46（退火溫度為54.8℃）重現性好、多態性明顯，對11 種棗樹幼葉的模板DNA 進行擴增，擴增結果見圖4。擴增電泳圖譜表明，11 種不同品種的條帶為4～7 條，主帶有2～3 條，次帶有2～4 條。依據主要條帶可以把所研究的棗樹品種分為3 類：駿棗、葫蘆棗、灰條棗歸為一類；脆棗、大團棗、團圓棗、梨棗，贊皇大棗歸為一類；木棗、狗頭棗、晉棗歸為一類。目前市場上很暢銷的狗頭棗在約1 300 bp處有一特異性條帶，可以和其他種類分開。

圖4 11 種棗樹品種特異引物擴增

3 討 論

從ISSR 的擴增結果來看，基于PCR 的ISSR 分子標記技術受到多種因素的影響，尤其是TaqDNA聚合酶濃度、引物濃度及退火溫度。Taq 酶濃度和質量對PCR 擴增結果相當重要[21]。Taq 酶濃度太低，會導致無擴增產物或產物量相當少；濃度過高不僅會造成經濟上的浪費，而且還會出現非特異性條帶，導致假陽性，甚至有時候還會出現一整條通帶[13]。引物濃度對PCR 的帶型產生也有明顯的影響，過低或過高濃度的引物都不能產生很好的擴增效果，這是由于引物濃度過低不能產生或只有極少量的擴增產物，而引物濃度過高會增加引物二聚體的形成，引起模板與引物錯配導致條帶不清晰或產生新的特異性位點使反應特異性下降[14]。退火溫度較高可以提高擴增的特異性，但過高也會使得酶的活性較早的消失，造成假陰性；過低會出現非特異性條帶，造成假陽性。筆者優化的最適退火溫度為54.8℃，這與劉興菊等[7]，齊靖等[15]的研究結果不同，這可能是由于試驗所用的材料品種差異造成的。

通過篩選的S46 引物，在優化的反應條件下，不同的品種中都能產生清晰、穩定的特征帶譜。狗頭棗可以用特有條帶把它與其他10 種棗區分開來。ISSR 通常為顯性標記，呈孟德爾式遺傳，從而表現出很好的多態性和穩定性，它具有可靠性高，技術難度低，多態性明顯，試驗可重復性好等優點，與RAPD、RFLP、AFLP、SSR 等分子標記方法相比，具有快捷、穩定、成本低、DNA 用量少和安全性較高等優勢[3]。從研究中可以看出，同一樣品、同一引物在相同的PCR 反應條件下，擴增結果完全一致，說明ISSR 技術的重復性和穩定性都很好。且瓊脂糖電泳檢測結果表明，ISSR 標記具有操作簡單的特點，容易在短時間內獲得大量的分子標記。因此，ISSR 技術已經受到了生物學者的高度重視，并在多種植物的遺傳研究中得到了應用。伴隨著ISSR標記技術的廣泛應用，必將會極大地加快棗屬植物分子標記領域的研究步伐，這將對棗種質資源收集保存、分類鑒定、品種選育和合理的開發利用具有重要的意義。

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