紅法夫酵母甘露聚糖的提取

梁新樂，王俊虎

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310012）

紅法夫酵母甘露聚糖的提取

梁新樂1，王俊虎2

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310012）

以紅法夫酵母DMSO法提取蝦青素后的剩余殘?jiān)鼮椴牧希?jīng)稀堿抽提以及費(fèi)林試劑絡(luò)合法提純制取得到粉末狀多糖，采用紙層析、紅外光譜、高效液相、氣相色譜分析最終分析確定該多糖為甘露聚糖，甘露聚糖得率4.65%，甘露糖與葡萄糖含量之比為4.3∶1；經(jīng)理化測(cè)定其總糖占90.5%，甘露聚糖占78.6%，蛋白含量是4.42%。研究堿法制取紅法夫酵母甘露聚糖的工藝條件，旨在為建立產(chǎn)業(yè)化可行的高效提取方法，拓寬紅法夫酵母的應(yīng)用領(lǐng)域提供參考。

紅法夫酵母；甘露聚糖；提取

甘露聚糖是酵母胞壁外包被著的一層膠狀糖蛋白，主鏈為D-甘露糖以α-（1，6）糖苷鍵形成的糖鏈[1-2]，是一種極具市場(chǎng)潛力的綠色飼料添加劑和食品添加劑。酵母甘露聚糖可促進(jìn)消化道內(nèi)有益菌生長(zhǎng)、維持消化道菌群動(dòng)態(tài)平衡[3]，有抗病毒、促進(jìn)傷口愈合、抗腫瘤、抗氧化和抗輻射的等生理活性[4]。一些研究表明甘露聚糖有抗腫瘤作用，它和脂多糖協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。體外發(fā)現(xiàn)TNF-α對(duì)腫瘤具有直接溶解和抑制增殖的作用，在體內(nèi)可引起腫瘤壞死，使腫瘤體積縮小甚至消退[5-6]。另外，甘露聚糖還是一種廣譜的霉菌毒素吸附劑，它可以吸附飼料中的多種霉菌毒素，尤其對(duì)玉米赤霉烯酮、T-2毒素、伏馬毒素，與之形成不可逆轉(zhuǎn)的復(fù)合物，并隨著糞便排出體外，從而避免霉菌毒素對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生不良影響[7]。

紅法夫酵母是生產(chǎn)蝦青素的酵母，提取蝦青素后還有大量的殘?jiān)茨芫C合利用。為此文章研究了從紅

法夫酵母細(xì)胞壁中提取甘露聚糖的工藝條件以及各階段提取物的理化性質(zhì)，并對(duì)提取物進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

甘露糖（BIO BASIC INC），葡萄糖（國(guó)藥集團(tuán)），木瓜蛋白酶（BIO SHARP）二苯胺（成都科龍），牛血清蛋白（TAKARA）；展層劑（體積比）：正丁醇∶冰醋酸∶水（4∶1∶5，體積比），充分振蕩，靜置后分層，棄去下層水層；顯色劑：二苯胺2 g，苯胺2mL，85%磷酸10mL，濃鹽酸1mL，丙酮100mL；單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：葡萄糖、甘露糖各0.100 0 g，溶于水，定容至25mL，葡萄糖和甘露糖濃度均為4.0 mg/mL；鹽酸羥胺溶液：1-甲基咪唑溶液為溶劑，60g/L。

1.1.2 儀器與設(shè)備

U-2800紫外/可見分光光度計(jì)：HITACHI公司；GZX-9240 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DKY-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床：上海杜科自動(dòng)化設(shè)備有限公司；FD-1冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MB45快速水分測(cè)定儀：美國(guó)奧豪斯儀器有限公司；H-2050R型高速冷凍離心機(jī)：湘儀儀器有限公司；RC6型高速冷凍離心機(jī)：SORVALL公司；NICOLET-380傅立葉紅外光譜儀：美國(guó)熱電公司；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司；V-700可控速PTFE隔膜真空泵：瑞士Buchi公司；低溫冷卻液循環(huán)泵：上海豫康科技儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種與培養(yǎng)基

紅法夫酵母（phaffia rhodozyma）4℃保藏于YM斜面，每三個(gè)月轉(zhuǎn)接一次；YM培養(yǎng)基成分（質(zhì)量濃度，g/L）：葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸出粉5；發(fā)酵培養(yǎng)基成分（質(zhì)量濃度，g/L）：葡萄糖10，酵母浸出粉5，蛋白胨5，（NH4）2SO43，MgSO4·7H2O 2.75，KH2PO41.5，CaCl2·2H2O 0.2。培養(yǎng)基初始pH調(diào)為5.4，若為固體培養(yǎng)基需加入2.5%的瓊脂粉。

1.2.2 培養(yǎng)條件

斜面上挑取一環(huán)菌種于YM液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后種子液以10%接種量接種到500mL三角瓶（含有YM培養(yǎng)基100mL）中，22℃，150 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48 h～72 h。

1.2.3 分析方法

總糖含量的測(cè)定：苯酚-硫酸法[8]；蛋白含量的測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)法[9]；粗蛋白含量的測(cè)定：凱式定氮法測(cè)定[10]；甘露糖含量的測(cè)定：紫外分光光度法[11]；水分含量的測(cè)定：快速水分測(cè)定儀測(cè)定；甘露聚糖純度鑒定：紙層析；分子構(gòu)型分析：紅外光譜法；

回收率：稱取一定量的葡萄糖加入相同體積的樣品液中，在樣品液水解條件下水解，最后測(cè)其含量，分別測(cè)三次求平均值，實(shí)驗(yàn)測(cè)其均值是0.85。

1.2.4 紅法夫酵母殘?jiān)墨@取

取發(fā)酵液于5 000 r/min下離心10 min，去離子水洗滌2次，收集菌體，用濾紙吸干管壁水滴，加入55℃預(yù)熱的二甲亞砜（DMSO），振蕩懸浮，加入丙酮，漩渦振蕩20 s～30 s，4℃，7 000 r/min離心10 min，去離子水洗滌兩次，收集殘?jiān)缇嗳杂猩芍貜?fù)抽提至白色為止[12]。

1.2.5 甘露聚糖提取工藝條件

洗凈的酵母細(xì)胞（1 g濕菌體加入1mL 6%KOH）用6%KOH在80℃處理90 min后9 000 r/min，10 min離心，之后用6%KOH洗滌沉淀一次，合并上清液。按2∶1體積比加入費(fèi)林試劑，0℃反應(yīng)15 min，沉淀用0.5 mol/L NaCl清洗后溶解于4 mol/L的HCl（常溫提3 h～4 h，1 g沉淀10mL HCl），用2倍體積乙醇4℃過夜得沉淀，9 000 r/min，10 min離心得粗甘露聚糖。取適量粗多糖在溫度55℃，pH 9.0，堿性蛋白酶濃度1.3%的條件下酶解5 h。酶解結(jié)束后調(diào)pH為中性，透析48 h低溫濃縮后冷凍干燥。費(fèi)林試劑絡(luò)合過程需重復(fù)3次。

1.2.6 紙層析

稱取多糖樣品10 mg，先用5mL 10 mol/L的硫酸水解5min鐘后加水將硫酸濃度稀釋至2 mol/L，封管后置于100℃水浴鍋中水解6 h，使水解完全，水解產(chǎn)物用碳酸鋇中和至pH 7.0，3 000 r/min離心10 min。取14 cm×15 cm濾紙，依次點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量20μL，放入層析缸，當(dāng)前沿離原點(diǎn)10 cm時(shí)停止，80℃恒溫箱顯色10 min[13]。

1.2.7 多糖分子量測(cè)定方法：高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）

儀器：Waters 600高效液相色譜儀（配2410示差折光檢測(cè)器和Empower工作站）。

色譜條件為色譜柱：UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8mmid×2；流動(dòng)相：0.1 mol/L硝酸鈉；流速：0.9mL/min；柱溫：45℃[14]。

樣品制備：稱取樣品100 mg于25 ml容量瓶中，用流動(dòng)相溶解，定容。

分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品（均購(gòu)置于sigma公司）：DextranT－2000（MW2000 000），DextranT-580（MW580 000），Dextran T－70（MW70 000），DextranT－10（MW10 000），Dextran T－5（MW2900），Maltaose（MW342）。

1.2.8 氣相色譜分析單糖種類及含量

儀器：Agilent Technologies 7890A GC System。

色譜條件為色譜柱：TR-35MS；氣化室250℃，檢測(cè)器（FID）250℃，柱溫160℃（保持10 min），以20℃/min速率升溫至200℃（保持5 min），以30℃/min速率升溫至230℃（保持5 min）。高純N2作載氣。柱流量1.20mL/min，分流比39∶1。

單糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的衍生：取單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，冷凍干燥后。加入鹽酸羥胺溶液1mL，充分溶解后，密封，90℃水浴反應(yīng)20 min，取出后冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，混勻，室溫反應(yīng)10 min。加入5.0mL三氯甲烷萃取產(chǎn)物，加入蒸餾水多次水洗，至水相無色為止，最后加適量無水Na2SO4吸去殘余水分[15]。

多糖水解液衍生：方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母粉和酵母殘?jiān)懈鹘M分含量的比較

酵母粉是鮮酵母泥經(jīng)冷凍干燥所得，酵母殘?jiān)?jīng)40℃恒溫烘箱烘干所得，紅法夫酵母提取蝦青素前后的各成分變化見圖1。

去除水分影響，酵母粉中總糖、粗蛋白、甘露糖的比例分別為42.15%、51.52%、10.53%，酵母殘?jiān)偺恰⒋值鞍住⒏事短堑谋壤謩e為48.01%、41.83%、12.55%。提起蝦青素后的細(xì)胞殘?jiān)鞍踪|(zhì)含量為原酵母粉的81.19%，多糖含量為原酵母粉的113.90%，甘露糖的含量是原酵母粉的125.12%。蛋白含量的降低以及總糖和甘露聚糖含量的升高都有利于以酵母殘?jiān)鼮樵线M(jìn)一步分離提取甘露聚糖。

2.2 甘露聚糖提取液理化特性研究

甘露聚糖提取液一般成分的含量見圖2。

由圖2可知，14.4 g干酵母殘?jiān)?jīng)堿提后可得到約100mL提取液，即含有1.012 g甘露聚糖，在此過程溶出率達(dá)70.08%，而沉淀中甘露聚糖占原料中甘露聚糖的16.23%，再次堿提甘露聚糖得率只有0.53%。較低的甘露聚糖浸提率主要是因?yàn)榧t法夫酵母細(xì)胞壁太厚。普通的酵母細(xì)胞壁是一個(gè)三層壁障致密結(jié)構(gòu)，其外層為甘露聚糖形成的糖蛋白、中層為堿溶性β-葡聚糖，內(nèi)層為堅(jiān)硬的堿不溶性β-葡聚搪[16]。紅法夫酵母的壁尤其堅(jiān)硬，一般酵母經(jīng)酸堿處理之后細(xì)胞壁都會(huì)被破壞，但是紅法夫酵母長(zhǎng)時(shí)間的高酸或高堿處理后部分細(xì)胞細(xì)胞壁仍然完整[17]。本文經(jīng)絡(luò)合法得粗多糖的得率為6.13%。

2.3 多糖樣品紙層析鑒定

甘露聚糖初步定性一般采用薄層色譜和紙層析，多糖的單糖組成分析見圖3。

從其中可看出純化后的多糖樣品水解產(chǎn)物與甘露糖單糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，并沒有出現(xiàn)二糖、三糖等寡糖的拖尾現(xiàn)象，這表明多糖樣品本身已被徹底水解。

純化后的多糖樣品水解產(chǎn)物與甘露糖相對(duì)應(yīng)位置上顯示相同的斑點(diǎn)，由此可知稀堿抽提以及費(fèi)林試劑絡(luò)合法提純酵母多糖的單糖組成主要為甘露糖[18]。

2.4 多糖樣品的紅外色譜

精制樣品經(jīng)KBr壓片，在4 000 cm-1～400 cm-1區(qū)間進(jìn)行紅外光譜掃描。紅外圖譜中含有多個(gè)多糖類物質(zhì)的特征吸收峰。圖4是多糖樣品的紅外色譜圖，如圖在3 401 cm-1處是O-H伸縮振動(dòng)引起的特征吸收，1 054 cm-1處為O-H變角振動(dòng)峰，在2 926 cm-1和1 372 cm-1處有兩組糖類C-H特征峰，分別代表了糖類C-H伸縮振動(dòng)與變角振動(dòng)，1 633 cm-1處有C-O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，870及810 cm-1處有不明顯吸收峰，說明含甘露糖[19]。

2.5 多糖分子量分布

圖5是甘露聚糖HPLC色譜圖，從圖5中可知甘露聚糖為單一對(duì)稱峰，這說明經(jīng)Fehling試劑純化后的甘露聚糖為均一組分。

2.6 氣相分析單糖種類

精制樣品的糖腈乙酸酯氣相色譜圖中出現(xiàn)兩個(gè)峰，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)單糖保留時(shí)間確定其為甘露糖和葡萄糖，根據(jù)二者的峰面積可知在甘露聚糖中甘露糖和葡萄糖的含量比是4.3∶1（如圖6～8）。綜合前面的分析可知樣品為甘露聚糖。

經(jīng)理化測(cè)定該方法甘露聚糖得率是4.65%，總糖占90.5%，甘露聚糖占78.6%，蛋白含量是4.42%，多糖產(chǎn)品為白色粉狀固體，無毒，無異味，易溶于水，沒有溶脹現(xiàn)象，溶液有黏性，pH為6.8。

3 結(jié)論

甘露聚糖的提取方法有多種：酶法、高溫高壓浸提法、堿浸提法、自溶法。酶法盡管比較溫和，但對(duì)酶的純度和專一性要求都比較高，并且酶法只能將甘露聚糖一部分水解下來[20]。高溫高壓檸檬酸鹽緩沖液浸提方法和高壓短時(shí)低酸法對(duì)設(shè)備的要求比較高，其環(huán)境溫度≥120℃，并且所得產(chǎn)物中β-葡聚糖所占比例也相對(duì)較高[19]。經(jīng)過DMSO法處理后紅法夫酵母活性也不高，無法采用自溶法，綜上考慮本文采用堿浸提法。

相對(duì)來說，堿浸提取法條件比較溫和，操作條件易于控制，水解作用主要是位于細(xì)胞壁中間的蛋白質(zhì)層[21]。此法使細(xì)胞中蛋白大部分轉(zhuǎn)化為氨基酸，余下蛋白經(jīng)堿性蛋白酶即可處理，所得甘露聚糖中基本上不含蛋白質(zhì)。

文章研究了甘露聚糖的提取方法，采用紙層析，紅外光譜，分子量，氣相色譜分析最終確定提取多糖為甘露聚糖，其得率是4.65%，經(jīng)氣相色譜可知甘露聚糖中甘露糖與葡萄糖含量之比為4.3∶1；總糖占90.5%，甘露聚糖占78.6%，蛋白占4.42%。

[1]艾自明,任慧霞.釀酒酵母胞壁多糖研究概述[J].中南藥學(xué),2009,7(10):762-765

[2]Kogan G,Pavliak V,andula J,et al.Structure of the cell wall mannans of the pathogenic yeasts of Candida species—A complex insight[J].Carbohydrate polymers,1990,14(1):65-76

[3]孫建義,李衛(wèi)芬.啤酒酵母甘露聚糖的提取及其對(duì)雞腸道微生物區(qū)系的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2001,27(4):447-450

[4]郭振楚.糖類化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:59-62

[5]Lene J,Martinus L,Stian L,et al.Combined cell wall polysaccharide,mycotoxin and bacterial lipopolysaccharide exposure and inflammatory cytokine responses[J].APMIS,2009,117(7):507-517

[6]Mihai G,Netea,Neil A R,et al.Immune sensing of Candida albicans requires cooperative recognition of mannans and glucans by lectin and Toll-like receptors[J].The journal of clinical investigation,2006,116(6):1642-1650

[7]楊乃歡,李彪.新型霉菌毒素吸附劑—酵母細(xì)胞壁提取物[J].中國(guó)牧業(yè)通訊,2009(21):23-24

[8]宮艷艷.酵母葡聚糖脂肪替代品的研究[D].無錫:江南大學(xué),2009:10-11

[9]王學(xué)圭.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].2版.北京:高等教育出版社,2006:190-191

[10]李亦兵,繆麗雯.食品分析[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2002:235-237

[11]張運(yùn)濤.啤酒廢酵母甘露聚糖的研究[D].無錫:無錫輕工大學(xué),1999:19-25

[12]鄭宗寶.基于基因組重排技術(shù)的紅法夫酵母蝦青素高產(chǎn)株選育[D].天津:天津大學(xué),2009:22-23

[13]王元秀,李峰.酵母多糖的提取、組分分析及對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].食品與藥品,2009,11(7):26-28

[14]王靜,戴軍,陳尚衛(wèi),等.提取酵母細(xì)胞壁中β-D-葡聚糖的新方法[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011(1):189-193

[15]廖燕芝,楊代明,張繼紅,等.氣相色譜法測(cè)定魔芋食品中葡甘聚糖及淀粉含量[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2008,27(4):66-69

[16]汪立平,王錫昌,陳有容,等.啤酒廢酵母甘露聚糖的制備[J].食品科學(xué),2009,30(2):134-137

[17]Xiao A F,N Hui,Cai H N,et al.An improved process for cell disruption and astaxanthin extraction from Phaffia rhodozyma[J].World J Microbiol Biotechnol,2009(25):2029-2034

[18]杜丹,趙春燕.啤酒酵母殘?jiān)崛「事毒厶堑难芯縖J].啤酒科技,2006(6):19-21

[19]汪文俊,劉玉蘭.紅法夫酵母甘露聚糖的提取與鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,47(5):584-586

[20]Valentin E,Herrero W E,Pastor J,et al. Solubilisation and analysis of mannoprotein molecules from the cell wall of Saccharomyces cerevisiae[J].Journal of general microbiology,1984,130 (6):1419-1428

[21]Ballou C.Structure and biosynthesis of the mannan component of the yeast cell envelope[J].Advances in microbial physiology,1976,14(11):93-158

Extraction Mannan from Phaffia Rhodozyma

LIANG Xin-le1,WANG Jun-hu2
（College of Food Science and Biotechnology Engineering,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310012,Zhejiang,China)

A kind of mannan was extracted from phaffia rhodozyma dregs which came from discarded phaffia rhodozyma after astaxanthin extracted and was fractionated by dilute alkali and Fehling's solution,etc.It was identified by assay of paper chromatography,infrared spectrum infrared spectroscopy,high performance liquid chromatography and gas chromatogram.The result indicated that the extractability was 4.65%,and the ratio of mannose and glucose was 4.3∶1 with 90.5%total sugar,78.6%mannan,4.42%protein.This paper studied the condition of producing mannan by chemical method.This research provides the basis for expanding the application of phaffia rhodozyma.

phaffia rhodozyma;mannan;extract

梁新樂（1969—），男（漢），教授，博士，主要研究方向：工業(yè)微生物菌種的篩選與發(fā)酵工程、生物轉(zhuǎn)化與酶催化、微生物生態(tài)學(xué)。

2011-11-17