亞甲藍血漿病毒滅活對凝血因子的影響

宋 敏，趙樹銘，劉鳳君，郭 輝，蔣天倫△

（第三軍醫大學西南醫院，1：輸血科；2：檢驗科，重慶 400038）

近年來，隨著人們生活水平和醫療保障水平的不斷提高，輸血的安全性問題，越來越受到公眾的重視和關注，雖然對獻血員都進行了篩選，但是由于當前科技水平的限制，檢測方法較為局限，存在病毒標記物檢測技術的局限性、窗口期、試劑敏感性、檢測病毒種類的局限性等［1］，血液輸注仍無法達到“零風險”。由于有些病毒顆粒片段存在于血漿中［2］，輸注血漿傳播某些傳染病的可能性高于全血，故對血漿進行病毒滅活是當前提高輸血安全性的重要措施。目前已有的血漿病毒滅活方法很多［3］，但對于單袋血漿病毒滅活最常用的是亞甲藍（MB）光化學法血漿病毒滅活［4－5］，該方法現已在我國多家血站實行。據報道，MB光化學血漿病毒滅活方法幾乎可以滅活所有細胞外的含脂薄膜病毒，如可經血液傳播的艾滋病毒（HIV），乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV）等［6］，但對于細胞內的病毒不具滅活作用，因此，在采用該方法進行血漿病毒滅活的同時，還需濾除血液中的白細胞［7］。但是，如果經過病毒滅活處理后，雖然殺滅或去除了可能存在的病毒，但卻對其中的有效血液成分的活性和（或）活力造成嚴重損傷，那就失去了病毒滅活的意義。尤其是現已證明冷沉淀是所有血液成分中病毒含量最高的［2］，用病毒滅活血漿制備冷沉淀就顯得尤為重要了?；诖耍狙芯繉涑恋淼闹饕行С煞智覍Σ《緶缁钶^為敏感的凝血因子Ⅷ（FⅧ）及纖維蛋白原（Fib）進行了如下實驗研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 日本藍橋血凝儀（Sysmex CA－7000），淄博中?？滇t用病毒滅活柜（ZBK－YBM－01），BECKMAN 低溫離心機（Jb－MC Centrifuge），SANYO速凍冰箱（CFC－free型），四聯采血袋（南京賽爾金），含有MB添加元件的病毒滅活柜配套一次性病毒滅活血袋（淄博中?？担?，Fib檢測試劑（德國 Marburg Lot：537511），FⅧ：C（FⅧ活性）檢測試劑（德國 Marburg Lot：500881B）。

1.2 標本來源 均來自本血站街頭無償獻血血液標本。隨機抽取16袋400mL全血，于6h內進行血液成分分離。將所得血漿充分混勻后無菌等量分裝于兩個相同空血袋內，熱合封口后分別歸為實驗組和對照組。同時留取血漿小辮子一份，做好標記用于檢測FⅧ及Fib。整個操作過程嚴格按照標準操作規程（SOP）文件（根據《血站質量管理規范》制定）要求進行。

1.3 血漿病毒滅活處理 采用一次性病毒滅活血袋對血漿進行病毒滅活處理主要有兩個步驟：光照及過濾。作者通過無菌操作將兩組血漿與一次性血漿病毒滅活專用血袋相連，其中實驗組血漿中加入 MB（濃度1μmol／L），對照組血漿中不加入MB，兩組血漿同時放入病毒滅活輻照箱內進行光照處理（光照強度25 000～30 000 1ux，溫度5～10℃，擺動頻率60次／分鐘條件下作用30min），光照后分別留取血漿小辮子一份，做好標記用于檢測FⅧ及Fib；按要求過濾后再分別留取血漿小辮子一份，做好標記備檢。將三組備檢小辮子立即放于－50℃冰箱速凍。整個操作過程嚴格按照SOP文件（根據《血站質量管理規范》制定）要求進行。

1.4 凝血因子檢測 3d后，于－50℃冰箱取出三組小辮子，37℃水浴箱中復溶后，立即檢測FⅧ及Fib。Sysmex CA－7000血凝儀檢測原理為免疫比濁法。檢測過程嚴格按照凝血因子檢測操作規程進行。

1.5 統計學處理 結果在SPSS11.0統計學軟件上進行t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

實驗組與對照組FⅧ：C及Fib濃度病毒滅活處理前后、光照前后變化差異有統計學意義（P＜0.05），見表1、2，兩組過濾前后比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表1 兩組血漿病毒滅活處理前后凝血因子減少值（±s）

表1 兩組血漿病毒滅活處理前后凝血因子減少值（±s）

組別 n FⅧ：C（%） Fib（g／L）對照組16 4.54±7.58 0.05±0.069實驗組16 32.81±10.47 1.06±0.260

表2 兩組血漿光照前后凝血因子減少值（±s）

表2 兩組血漿光照前后凝血因子減少值（±s）

組別 n FⅧ：C（%） Fib（g／L）對照組16 4.27±8.22 0.01±0.066實驗組16 32.63±11.37 0.95±0.290

表3 兩組血漿過濾前后凝血因子減少值（±s）

表3 兩組血漿過濾前后凝血因子減少值（±s）

組別 n FⅧ：C（%） Fib（g／L）對照組16 0.27±4.83 0.04±0.029實驗組16 0.18±6.36 0.11±0.280

3 討 論

MB光化學法血漿病毒滅活技術已相當成熟，該方法進行血漿病毒滅活操作簡便，且能滅活幾乎所有有包膜病毒［8］，但是，關于用MB光化學法病毒滅活后的血漿能否用于制備符合質量要求的冷沉淀還尚有爭議［9－12］。本實驗中將同一人份血漿均分為兩份，分別進行加入MB與未加MB光照處理，觀察MB光化學法血漿病毒滅活對冷沉淀中較為重要且較敏感的凝血因子的影響，實驗結果顯示，MB光化學法血漿病毒滅活對FⅧ及Fib均有較大程度上的影響。加入MB的實驗組血漿經病毒滅活后，FⅧ：C平均損失率達40.5%，Fib平均損失率達47.6%，與未加入MB的對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。同時由三組數據對比可看出，病毒滅活過程中FⅧ：C及Fib的損耗主要來源于MB光化學反應，而單純光照處理影響不大，且實驗組和對照組過濾前后FⅧ：C及Fib濃度的損失率相比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本實驗中，考慮到冷沉淀制備過程中人為因素影響較大，如冷沉淀中血漿保留量的影響等，未直接跟蹤檢測在制備為冷沉淀以后凝血因子的水平，而是留取檢測標本后均按照冷沉淀原料血漿保存過程處理：三組小辮子標本留取后立即放于－50℃冰箱速凍，待3 d以后于37℃水浴箱中復溶待檢，故本實驗可以對制備成冷沉淀后質量進行預測。由于通過常規標準操作制備冷沉淀時，凝血因子也還會有一定的損失，故由實驗結果可看出病毒滅活血漿制備為冷沉淀后凝血因子活性不符合質量要求標準。因此，在血液成分制備中，可考慮先將新鮮冰凍血漿制備成冷沉淀后再將血漿進行病毒滅活。

目前輸血安全性已獲得顯著提高，總體上血液已非常安全，但是由于病毒窗口期以及檢測試劑靈敏度等問題，仍然存在輸血傳播艾滋病和肝炎等傳染病的危險。據報道美國90%以上輸血傳播HIV和HBV以及75%以上輸血傳播HCV的危險均來自窗口期感染獻血［13］。我國血站主要采用ELISA（酶聯免疫吸附試驗）方法對血液中HBV，HCV及HIV等進行檢測，該法試劑靈敏度差異較大且窗口期較長［14］，而據報道即便是用靈敏度較高的核酸檢測也只能將HIV檢測窗口期由22d縮短到12d，HCV檢測窗口期由70d縮短到14d［15］。另外尚有很多未被認識或一時難以找到有效檢測手段的病毒存在經輸血傳播給受血者的危險。因此，對血液成分進行病毒滅活處理，是從根本上控制或杜絕經輸血途徑傳播疾病的重要措施?，F在都提倡成分輸血，對于所有血液成分中病毒含量最高、輸注危險性最大的冷沉淀，則更應進行病毒滅活處理后用于臨床。但是我國目前推廣使用的MB光化學法血漿病毒滅活對血漿中一些有效成分，尤其是凝血因子影響較大，病毒滅活后血漿不適合用于制備冷沉淀，因此，還有待努力尋找一種更安全可靠的病毒滅活技術，以更大限度地提高輸血安全性。

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