北京地區發現番茄斑萎病毒

李 飛， 吳青君， 徐寶云， 謝 文， 王少麗， 張友軍

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

西花薊馬［Frankliniella occidentalis （Pergande）］是世界性的、園藝作物上最重要的害蟲之一［1］，2003年在我國首次發現并迅速上升為保護地蔬菜和花卉上的主要害蟲之一［2］。西花薊馬除可以直接取食造成危害外，還能夠傳播多種植物病毒，西花薊馬是番茄斑點萎蔫病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）最有效的傳播媒介，其傳播病毒病造成的危害損失遠大于其本身的危害。番茄斑萎病毒屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus），于1915年由Brittlebank首次在澳大

利亞發現，現已在世界上多個國家和地區廣泛分布，侵染煙草、大豆、番茄、花生、辣椒、萵苣、菊花等作物及多種雜草等900多種植物，是全世界10種危害性最大的植物病毒之一［3］，在我國被列為進境植物檢疫的危險性有害生物。雖然我國早在1984年就從花生上分離到 TSWV［4］，在四川曬煙上也發現TSWV的危害［5］，但其后的10多年來并未廣泛流行，因此未有進一步的研究。近年來，在西花薊馬發生重災區的云南，不斷在花卉和煙草上檢測到番茄斑萎病毒屬病毒，并呈迅速蔓延之勢，對云南的煙草和花卉產業已構成巨大威脅［6－7］。

2012年5 月，筆者在田間調查時發現西花薊馬為害嚴重的辣椒上出現枯斑、黃色環狀紋等疑似番茄斑萎病毒病的癥狀，作者對海淀區疑似植物樣品和西花薊馬發生嚴重的昌平地區的植物樣品進行了鑒定，并測定了植物上發生的西花薊馬是否攜帶番茄斑萎病毒。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

辣椒葉片采于海淀區的2個日光溫室和1個連棟玻璃溫室內，葉片表現褪綠環斑、壞死斑、同心環癥狀，采回實驗室立即鑒定。茄子樣品采于昌平的日光溫室，葉片表現黃綠不均，成斑駁狀，上面有薊馬幼蟲及為害狀。分別從兩種作物上采集50頭左右薊馬，首先鑒定是否為西花薊馬，然后檢測是否帶毒。

1.2 主要試劑

Trizol總RNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa RT－PCR試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq 10Master Mix，北京奧賽博科技發展有限公司；蛋白酶K，天根生化科技（北京）有限公司；樹脂，Sigma公司；TSWV快速檢測試紙條，安德珍生物技術（北京）有限公司。

1.3 薊馬種類的鑒定

薊馬基因組DNA的提取參照White等的方法并稍加改進［8］。將單頭西花薊馬置于滴有3μL蛋白酶K parafilm膜上，以200μL PCR管底部作為勻漿器充分研磨，勻漿液移入200μL PCR管，然后加入20μL的樹脂，混勻之后置于37℃恒溫水浴1 h，每隔15min振蕩1次，然后金屬浴96℃10min，于－20℃保存備用。西花薊馬的鑒定參照孟祥欽SCAR分子檢測技術［9］，上游引物堿基序列為：5′－GAAACTACTATTGTTTGTGAGCTG－3′，下游引物 堿 基 序 列 為：5′－AAGAAACTAAC－GTGAAGGATACTC－3′。

1.4 TSWV快速試紙條檢測

取一片3cm×4cm帶有疑似癥狀的葉片，將葉片放入提取液瓶中，蓋緊蓋子用力搖動20s，直到液體變為暗綠色。然后用滴管將液體滴2滴到試紙條的點樣孔中，大約30s后可以看到試紙條的窗口區變為藍色，等到對照C線顯現后，即可查看結果。如果T線顯現，說明該樣品為陽性，T線的顏色比較深說明帶毒量比較高，顏色淺說明帶毒量少，如果沒有T線，說明該樣品為陰性。

1.5 RT－PCR檢測

參考天根的Trizol總RNA提取試劑盒說明書提取葉片及西花薊馬的總RNA，樣品于－80℃保存備用。然后按照TaKaRa RT－PCR試劑盒說明書進行cDNA的合成，－20℃保存樣品。采用Vaira等［10］設計的引物：NF302：5′－GGGTCAGGCTTGTTGAGGAAAC－3′ 和 NR575：5′－TTCCCTAAGGCTTCCCTGGTG－3′。PCR 反應體系為 20μL：cDNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、2×Taq10Master Mix 10μL、ddH2O 7μL，PCR程序為94℃預變性2min；40個循環：94℃30s、60℃30s、72℃30s；最后72℃延伸5min［11］。擴增后的產物用1.5%凝膠電泳檢測，預測條帶為273bp。

將PCR產物交由北京六合華大基因科技股份有限公司（BGI）測序，將獲得的序列通過BLAST進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 薊馬種類的鑒定

以薊馬的DNA為模板，以2條SCAR引物：FOMF／FOMR分別進行擴增。電泳檢測結果顯示，能擴增出一條西花薊馬特有的條帶，得到320bp左右的目的片段（圖1），表明上述植物上發生的薊馬種類為西花薊馬。

圖1 薊馬種類鑒定結果電泳圖

2.2 TSWV試紙條檢測結果

用滴管將葉片提取液滴2滴到試紙條的點樣孔中，約30s后可以看到試紙條的窗口區變為藍色，大約2min后對照C線顯現，具有褪綠環斑的葉片均顯示T線（圖2a），表明該葉片均帶有番茄斑萎病毒。而癥狀輕的葉片，T線不明顯（圖2b），需進一步驗證。

2.3 RT－PCR檢測結果

采用引物NF302／NR575對番茄斑萎病毒屬病毒N基因序列進行RT－PCR擴增，表現褪綠環紋癥狀的辣椒葉片樣品、癥狀不明顯的辣椒和茄子樣品以及同時采集的西花薊馬均可獲得273bp左右的目的條帶（圖3、圖4），與預期結果一致，表明采集的辣椒、茄子樣品可能被番茄斑萎病毒侵染，西花薊馬可能攜帶番茄斑萎病毒。

圖2 TSWV試紙條檢測

2.4 獲得目的片段的序列比對

將測得的目的基因片段進行序列測定，通過BLAST比對發現所擴增的273bp與番茄斑萎病毒屬病毒的N基因序列有98%的相似性，進一步證明上述植物樣品的確受番茄斑萎病毒屬病毒侵染，而且薊馬體內也攜帶番茄斑萎病毒屬病毒。

3 討論

通過采用番茄斑萎病毒的快速試紙條檢測，以及進一步的RT－PCR和序列測定證實，在北京局部地區的辣椒和茄子上已發生番茄斑萎病毒病，這兩種作物上同時發生的薊馬種類主要為西花薊馬，并且攜帶該病毒。由薊馬傳播的番茄斑萎病毒位列世界10大重要病毒病的第2位［3］，曾對西班牙東南部的溫室番茄、辣椒和花卉造成的經濟損失達到50%［12］，在美國夏威夷、巴西、意大利和南非，番茄斑萎病毒病在20世紀80－90年代的某些年份流行導致番茄、萵苣等作物近乎絕產［13］。眾所周知，西花薊馬目前已遍布我國北京、云南、山東、貴州、新疆等地［14］，對各地的蔬菜和花卉作物造成嚴重危害。世界各國的事實表明，伴隨西花薊馬在世界范圍內的廣泛傳播與擴散，常導致番茄斑萎病毒病的發生與流行。如果由西花薊馬傳播的番茄斑萎病毒病大面積發生，加上種苗調運的遠距離傳播，將對我國農作物特別是經濟價值高的蔬菜和花卉作物生產造成毀滅性的災害。為此，建議有關部門立即采取相應的預防與管理措施，首先查明番茄斑萎病毒病在我國的分布現狀，同時開展相應的控制技術研究，防止其擴散蔓延。

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