系統性紅斑狼瘡患者靜脈血BCMA和CD138＋漿細胞的研究＊

牛曉昶，曾照芳，賈 佳，李艷林，夏 季，黃恒柳，鄧少麗△

（1.第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所檢驗科，重慶400042；2.重慶醫科大學檢驗系 400016；3.重慶醫科大學附屬兒童醫院 400014）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）簡稱紅斑狼瘡，是由多克隆自身反應性B細胞介導的自身免疫性疾病，B細胞異常激活并異常分化為漿細胞和記憶性效應細胞，其直接的致病因子是多克隆自身抗體，并以免疫復合物的形式造成多種組織器官損傷。雖然目前對于引起SLE的確切病因仍不明確，但是SLE中異常漿細胞分泌多種致病性自身抗體導致SLE的發生已成共識，這些抗體主要來源于漿細胞。漿細胞存活及其抗體分泌功能主要由B淋巴細胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）調控，雖然BCMA作用的相關機制至今尚未完全清楚，但是已有研究顯示BCMA在漿細胞的存活中發揮重要作用［1］。因此，阻斷BCMA可選擇性抑制漿細胞的存活，減少抗體的分泌，BCMA成為治療SLE的潛在靶點。白細胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）138是漿細胞特異的膜抗原，是成熟漿細胞的標記。本研究從BCMA蛋白維持漿細胞存活的角度出發，探討BCMA表達和CD138＋漿細胞數量在SLE患者和健康人體內存在的差異，為研究SLE的發病機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 主要試劑包括：人BCMA酶聯免疫吸附測定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自美國R＆D公司，Ficoll細胞分離液購自美國GE公司，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）購自北京中衫金橋生物技術有限公司，Trizol為Invitrogen公司產品，焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）原液為Sigma公司產品，實時聚合酶鏈反應（real time－polymerase chain reaction，RTPCR）試劑盒購自Promega公司。抗CD138－藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、CD38－異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、CD19－FITC、CD45－藻紅蛋白－花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PC5）、CD56－PE、IgG1－PE／IgG1－FITC／IgG1－PC5抗體均購自BECKMAN公司，Taq酶購自Promega公司。主要儀器包括：CFX－96實時熒光定量PCR儀（Bio－Rad公司）、ND－1000微量紫外可見分光光度計（美國Nanodrop公司）、流式細胞儀（美國Backman公司），MK3酶標分析儀（芬蘭雷勃公司）。

1.2 材料 選擇2009年4月至2011年6月于第三軍醫大學大坪醫院就診的40例臨床確診的SLE患者作為SLE組，均符合1997年美國風濕病學會修訂的SLE診斷標準，年齡15～54歲，平均（34.0±6.0）歲。將同期進行健康體檢的30例健康人作為對照組，年齡26～49歲，平均（35.0±5.0）歲。取上述患者及健康人的靜脈血進行研究，采集的血液標本用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝。

1.3 引物 BCMA 引物：上游5′－GCA TCA AGA GCA AAC CGA AGG－3′，下游5′－TCT ATC TCC GTA GCA CTC AAA GC－3′；BCMA 熒光探針：FAM－5′－CGA CTC TGA CCA TTG CTT TCC ATC CCC A－3′。B2 M 引 物：上 游 5′－TCC ATC CGA CAT TGA AGT TGA C－3′，下 游 5′－ACT ATC TTG GGC TGT GAC AAA G3′；B2 M 探 針：FAM－5′－TGG TTC ACA CGG CAG GCA TAC TCA－3′。上述引物和熒光探針均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.4 ELISA法檢測 BCMA （1）包被：以 PBS將72μg／mL捕獲抗體稀釋至終濃度為0.4μg／mL，將其加入空白微孔板（100μL／孔），室溫過夜，0.05%Tween20洗滌液洗板3次，甩干；（2）封閉：以試劑稀釋劑（含1%牛血清清蛋白的PBS液）封閉微孔，每孔300μL，室溫放置至少1h，0.05%Tween20洗滌液洗板3次，甩干，備用；（3）加樣：以試劑稀釋劑稀釋重組人BCMA標準品，對倍稀釋，稀釋后終濃度為31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00、2 000.00pg／mL，將其 分 別加入100μL標準液或待測血清，室溫放置2h，以0.05%Tween20洗滌液洗板3次，甩干；（4）加入生物素化羊抗人BCMA抗體：以試劑稀釋劑將36μg／mL檢測抗體稀釋至終濃度為200ng／mL，每孔100μL，室溫放置2h，0.05%Tween20洗滌液洗板3次，甩干；（5）加入鏈霉親和素－辣根過氧化物酶（streptavidin－horseradish peroxidase，SA－HRP）：SA－HRP以試劑稀釋劑按1∶200稀釋后加入微孔中，每孔100μL，避免強光直射，放置室溫20min，以0.05%Tween20洗滌液洗板3次，甩干；（6）顯色、測定：每孔加入顯色劑A和顯色劑B各50μL，避免強光直射，放置室溫20min后加入終止液50μL，在酶標儀上讀取450nm處光密度（optical density，OD）值；繪制標準曲線，計算待測樣本的BCMA含量。

1.5 單個核細胞RNA的提取 用Ficoll細胞分離液通過離心（離心半徑9cm，2 000r／min離心20min），將標本中的單個核細胞分離出來，用1%PBS洗滌，然后再離心（2 500r／min離心10min），去上清液，留單個核細胞于管底。用Trizol破裂細胞，氯仿、異丙醇和75%乙醇萃取、沉淀，提取細胞RNA，將RNA溶解在無核酸酶水中，測定其濃度和純度，為不影響實驗結果，濃度應不小于300ng／μL，A260／A280不小于2.0。根據RT－PCR試劑盒說明書取1mg RNA進行逆轉錄得到cDNA，－20℃凍存備用。

1.6 熒光定量RT－PCR檢測 反應體系：Free water 3.4μL、Mix混合液5.0μL、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、BCMA探針0.3μL、Taq酶0.2μL、cDNA 0.5μL、總體積10.0μL。PCR反應條件：95℃預變性3min后，95℃變性10s，58℃退火30s，共45個循環。計算的周期閾值（cycle threshold，Ct），根據相對定量2－ΔΔCt法計算SLE組和對照組靜脈血BCMAmRNA的差異。

1.7 流式細胞術檢測 將兩組標本在Ficoll細胞分離液的作用下離心（離心半徑9cm，2 000r／min離心20min），收集單個核細胞，用1%PBS洗滌。將 CD138－PE、CD38－FITC、CD19－FITC、CD45－PC5、IgG1－PE／IgG1－FITC／IgG1－PC5熒光抗體標記的單 個 核 細 胞 分 為 3 組：（1）CD38－FITC、CD138－PE 及CD45－PC5標記細胞組；（2）CD19－FITC、CD138－PE 及 CD45－PC5標記細胞組；（3）IgG1－PE／IgG1－FITC／IgG1－PC5及 CD45－PC5標記細胞組。3組細胞均孵育1～2h后上機檢測。

1.8 統計學處理 應用SPSS12.0軟件進行統計學處理，計量數據用±s表示，組間差異的比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清ELISA檢測分析 SLE組患者血清BCMA水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 SLE患者與健康者血清BCMA水平的比較

2.2 熒光定量RT－PCR分析 經45次循環，熒光定量RTPCR反應曲線見圖1。SLE組患者的ΔCt值明顯高于對照組的ΔCt值，差異有統計學意義（P＜0.05），SLE組為0.811，對照組為1.716。經2－ΔΔCt法計算（－ΔΔCt＝SLE組－對照組），SLE組患者BCMA基因的含量是對照組的1.873倍，見圖2。

圖1 熒光定量RT－PCR反應曲線

圖2 SLE組和對照組的ΔCt分布情況和ΔCt值

圖3 SLE組（左）和對照組（右）患者的流式細胞術檢測結果

2.3 流式細胞術分析 流式細胞技術檢測結果顯示，SLE組患者靜脈血漿細胞數量明顯高于對照組，見圖3。

3 討 論

BCMA為B細胞表面分子，是由184個氨基酸殘基組成的非糖基化單鏈Ⅰ型蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家 族，是 Ⅰ 型 跨膜受體［2］。BCMA 表達于 B細胞的生發中心［3］、成熟 B細胞［4－5］以及成熟漿細胞 表 面［1，6］。B 細 胞 激 活 因 子 （B cell activating factor，BAFF）是B細胞產生、發育和自身反應所必需［7－9］。BCMA可與BAFF配體相結合，其可能機制是BCMA與BAFF蛋白結合，使抗凋亡基因Bcl－2、Mcl－1的表達上調，維持漿細胞生長，成為長壽漿細胞，從而增加成熟漿細胞的數量及其抗體的分泌［9］。在自身免疫疾病患者，尤其是SLE患者體內可檢測出高水平的BAFF［10－11］，因此，在維持漿細胞的存活中BCMA 發揮了重要的作用。BCMA基因位于16p13，mRNA全長約1.2kb［12］。人類漿細胞、生發中心 B淋巴細胞［3］以及小鼠漿細胞的BCMA表達明顯升高，其缺失會縮短骨髓長壽漿細胞生存時間［1］。分析B細胞發育過程的基因表達譜，發現BCMA隨著B細胞的發育成熟而出現，其表達量逐漸增加，且只表達于成熟B淋巴細胞及漿細胞，為維持漿細胞存活所必需，在B細胞發育的時空性上具有一致性［13］。BCMA雖在生發中心B細胞中表達，但它對外周B細胞的數量、各種外周B細胞亞型的分布以及B細胞的壽命沒有明顯影響，在成熟B細胞分化到漿細胞階段，其BCMA表達較多，BCMA可能與調控漿細胞存活及抗體分泌功能有關。漿細胞是致病性自身抗體的直接來源，40%自身抗體分泌性漿細胞是長壽命的，長壽漿細胞產生的自身抗體可反復激活潛在的病理免疫應答反應［14］。BCMA基因剔除小鼠有正常的脾結構，B細胞發育正常，T細胞非依賴性免疫反應和T細胞依賴性免疫反應未見明顯異常，但漿細胞數量明顯減少，這又證明BCMA在維持漿細胞存活中的重要性［1］。

CD138＋能特異性地標記成熟漿細胞，本研究利用這一特征對SLE組和對照組靜脈血的單個核細胞進行流式細胞術分析，比較兩組CD138＋漿細胞數量的差異。本研究將熒光定量RT－PCR技術、流式細胞術及ELISA結合，研究維持漿細胞存活的重要因子BCMA。其結果顯示SLE組血清BCMA明顯高于對照組，SLE組體內BCMA基因表達的相對量是對照組的1.873倍，且流式細胞術顯示SLE組患者靜脈血CD138＋漿細胞的數量也明顯高于對照組，提示在SLE患者體內BCMA基因高表達，SLE患者體內漿細胞數量的增加與BCMA高表達相關，這為進一步了解SLE發病機制提供了新的線索，為SLE治療提供了新的方向和靶點。

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