長白豬微衛星標記的遺傳多樣性

鞏元芳，段玲欣，倪 靜，吳建華，任鐵艷王沛芳，劉錚鑄，李鳳敏

(1河北科技師范學院動物科技學院，河北省預防獸醫學重點實驗室，河北秦皇島，066600;2河北省宣化縣職業技術教育中心)

微衛星是20世紀80年代末期發展起來的一種新型DNA標記，一般由1～6 bp的短核苷酸為核心序列，呈串聯重復狀分布于生物整個基因組，重復數在10～20次之間，具有分布廣泛、多態信息含量高、呈共顯性遺傳、穩定性好、保守性強及檢測方便快速等特點而倍受青睞，被廣泛用于評估生物遺傳多樣性、構建高分辨率的遺傳連鎖圖及復雜相關基因定位等的研究［1］。聯合國糧農組織(FAO)在其持續發展和管理動物遺傳資源的戰略計劃中，也將微衛星標記作為優先推薦的分析工具［2］。

長白豬原產于丹麥，原名蘭德瑞斯(Landrace)，是世界上第一個育成的最著名的瘦肉型品種，它是丹麥本地豬與英國大白豬雜交，經過長期系統選育形成的，迄今已有70多年歷史。由于該品種具有適應性好、生長快、遺傳性穩定、飼料利用率高，而且母豬產仔數多、泌乳性能好、斷乳窩重較高以及胴體瘦肉產量高等優點，所以在當代世界范圍內成為數量最多、分布最廣的一個瘦肉型品種［3］。

目前，對于長白豬，有關借助微衛星標記對其遺傳結構和遺傳多樣性方面的研究鮮有報道?；谝陨涎芯勘尘?，本研究利用3個微衛星標記在長白豬中進行遺傳多樣性的分析，以期為長白豬遺傳資源保護和合理的開發利用等提供科學依據。

1 材料與方法

1．1 試驗豬群及樣品的采集

80頭長白豬來自于中國農科院保種場，所有試驗豬身體健康，在常規飼養環境下飼養。用消毒過的耳號鉗采取3 mm×6 mm大小的耳組織2～3塊，放于盛有體積分數為0．70的分析醇的EP管中，－20℃保存待用。

1．2 基因組DNA的提取

采用常規的酚-氯仿抽提法［4］。

1．3 微衛星標記的選擇

根據USDA-MARC(美國肉畜中心)最新豬微衛星標記遺傳連鎖圖，選擇擴增效果好、多態信息含量大、重復次數多、等位基因數目在4個以上的微衛星座位作為研究對象［5］。為了實現微衛星多態性的熒光半自動檢測，必須對引物進行熒光修飾，即在上游引物的5’端加上發光基團。當熒光引物擴增的PCR產物在ABI377測序儀上進行電泳檢測時，在激光的激發下熒光基團發光，系統自動收集熒光信號，從而獲得PCR產物的數據信息。所選微衛星標記的相關信息如表1和表2所示。

1．4 微衛星標記的PCR擴增及反應條件

PCR 反應總體積為 20．0 μL，其中 10 × buffer(含 15 mmol/L MgCl2的緩沖液)2．0 μL，dNTPs 1．6 μL，上下游引物(10 μmol/L 的引物)分別為0．4 μL，模板 DNA 1．0 μL，TaqDNA 聚合酶(5 ×106 U/L)0．1 μL，雙蒸水 14．5 μL。

PCR 反應條件為94℃預變性5 min;94℃變性30 s，55．8～66．8℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環;72℃總延伸10 min，最后4℃保存。

表1 3個微衛星標記的相關信息

1．5 電泳檢測

每次PCR反應設不含模板的空白對照，擴增產物經質量濃度為25 g/L的瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠自動成像儀上檢測。

表2 3個微衛星標記的引物序列、退火溫度及熒光修飾情況

1．6 微衛星基因型的分型

利用ABI377自動DNA測序儀和GeneScan V3．7軟件進行微衛星基因型的檢測和分型。

1．7 數據的整理與統計分析

微衛星呈共顯性遺傳，對測得的基因型做簡單統計即可計算出等位基因頻率［6］。本研究采用Pop-Gene32(ver1．31)軟件和自編程序進行了微衛星基因座的群體遺傳變異分析，其中，進行了每個微衛星標記的等位基因頻率、有效等位基因數(Ne)和遺傳雜合度(H)的計算，用自編程序進行了多態信息含量(PIC)的計算。

式中，pi為第i個等位基因的頻率，n為等位基因數。

式中，pi為某一位點上第i個等位基因頻率，n為某一位點的等位基因數。

式中，pi，pj分別為群體中第i，j個等位基因頻率，n為等位基因數。

2 結果與分析

圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

2．1 基因組DNA的提取結果

基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。由圖1可以看出，DNA條帶清晰，DNA量較大，點樣孔干凈，說明提取的豬基因組DNA無蛋白質污染。

2．2 微衛星標記的基因型判定

2．2．1 PCR產物的瓊脂糖電泳檢測結果 3個微衛星標記的擴增產物在25 g/L的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，結果如圖2所示?？梢钥闯?，每孔都有產物，且所有條帶濃度均勻一致，適合進行后期的GeneScan檢測。ESTMS20，SW2570和S0002的PCR產物網上公布分別在111～131 bp，152～178 bp和189～212 bp之間，而圖2(a)近100 bp有1條帶，圖2(b)在100 bp和200 bp之間有1條帶，圖2(c)在近200 bp有1條帶，這些結果與網上公布的基本一致。事實上后期經GeneScan檢測在長白豬中ESTMS20的產物在113～135 bp之間，SW2570的產物在158～180 bp之間，S0002的產物在189～209 bp之間。

2．2．2 利用GeneScan V3．7軟件完成基因型的分型 圖3是3個微衛星標記經GeneScan V3．7軟件識別后的等位基因情況，ESTMS20只有1個等位基因，SW2570和S0002均有2個等位基因。

2．3 3個微衛星標記的等位基因頻率、有效等位基因數(Ne)、遺傳雜合度(H)和多態信息含量(PIC)

觀察3個微衛星標記的等位基因頻率，各等位基因分布不均勻，每個微衛星標記都有其優勢等位基因的存在(表3)。在3個微衛星中，ESTMS20多態性最小，等位基因數為4個，以123 bp的頻率最高，其頻率為0．44。SW2570和S0002的等位基因數均為5個，而在SW2570的擴增結果中，158 bp頻率最高，其頻率為0．35，其次是178 bp，其頻率為0．33;在S0002的擴增結果中，207 bp的頻率最高，其頻率為0．75。另外，3個微衛星標記在長白豬群體中的遺傳雜合度為0．41～0．70;多態信息含量為0．38～0．65，有效等位基因數為 1．7 ～3．4。

3 討 論

圖2 3個微衛星擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

有效等位基因數(Ne)是遺傳純合度的倒數，它表明等位基因間的相互影響，反映其實際作用的等位基因數目，也可以作為群體遺傳變異的一個測度。等位基因在群體中分布越均勻，有效等位基因數越接近檢測的等位基因絕對數［5］。由表3可以看出，本研究中的ESTMS20和SW2570在群體中分布比較均勻，而S0002中存在1個分布極顯著的等位基因(207 bp)，由此推測此等位基因在遺傳上起的作用可能更大一些。根據微衛星的選擇標準［2，7］，每個微衛星位點有4個等位基因，可以使每個位點的有效等位基因數大于2，本研究的3個微衛星的有效等位基因數分別為3．3，3．4和1．7(接近于2)，由此表明這3個微衛星均可用于長白豬遺傳多樣性的評估。

遺傳雜合度(H)的大小能近似反映出群體遺傳結構和變異程度的高低。雜合度越高，群體的遺傳多樣性越高［5，8］。ESTMS20，SW2570和 S0002在長白豬中的雜合度分別為0．69，0．70 和0．41，平均雜合度為0．60，與 Nei等［9］報道的微衛星雜合度(0．3～0．8)以及澤格·歐特［10］對基因雜合度不小于0．1的要求基本一致。由此可見，本研究的3個微衛星標記均具有較高的多態性。

多態信息含量(PIC)也是衡量位點多態性的一個重要指標［5］，Bostein 等［6］和 Cooper等［11］均以 0．25 和 0．50 作為位點多態性高、中、低不同層次的分界標準，他們認為當PIC＞0．50時，標記具有高度可提供的信息;當0．25＜PIC ＜0．50，標記能較合理的提供信息;當PIC＜0．25，標記提供的信息量較差，本研究中的3個微衛星標記在長白豬中的PIC分別為0．64，0．65和0．38，平均PIC為0．57，這又一次證明本研究的3個微衛星在長白豬中均為高度多態位點。

綜上所述，長白豬群體內的遺傳多樣性都比較豐富，具有較高的選擇潛力，所選3個微衛星標記能夠用于長白豬的群體遺傳多樣性的分析。本研究結果將為今后很好利用和開發長白豬提供較好的參考依據。

4 結 論

本研究采用ESTMS20，SW2570和S0002等3個微衛星標記對長白豬進行了遺傳多樣性的研究。結果發現，3個微衛星標記在長白豬中均具有多態性，基因雜合度分別為0．69，0．70和0．41，多態信息含量分別為0．64，0．68和0．38，由此推測，這3個微衛星標記在長白豬群體中屬于高度多態性座位，可以用于長白豬遺傳多樣性的評估。

圖3 3個微衛星通過GeneScan V3．7軟件的判型結果

表3 3個微衛星標記在長白豬中的有效等位基因數(Ne)、遺傳雜合度(H)、多態信息含量(PIC)和等位基因頻率

［1］張桂香，王志剛，孫飛舟，等．56個中國地方豬種微衛星基因座的遺傳多樣性［J］．遺傳學報，2003，30(3):225-233．

［2］BARKER J S F．A global protocol for determining genetic distances among domestic livestock breeds［J］．proc 5th world cong genet appl livest prod，1994，21:501-508．

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