Bcl-2過度表達對全腦缺血再灌注后大鼠海馬回P53蛋白表達的影響

李 偉，吳 剛，薛榮亮

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004)

在腦缺血再灌注損傷中，程序性細胞死亡即凋亡是腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元死亡的主要方式，對其機制的研究是目前的熱點。研究[1]表明：細胞凋亡受多種基因調(diào)控，Bcl-2與p53被認為是最重要的調(diào)控基因。p53可調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與DNA復(fù)制與損傷修復(fù)，誘導(dǎo)凋亡。所以，p53及其相關(guān)基因的表達已成為目前腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Bcl-2是凋亡重要調(diào)控基因，目前認為，Bcl-2可抑制細胞凋亡，其家族基因在調(diào)節(jié)線粒體通透性中發(fā)揮重要作用。在腦缺血再灌注損傷中Bcl-2對p53表達有無影響尚未見相關(guān)研究報道。因此，本研究利用過度表達Bcl-2的大鼠，研究其腦缺血再灌注后P53蛋白的表達，探討B(tài)cl-2的抗凋亡作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑4%多聚甲醛、磷酸鹽緩沖液(PBS)及Poly-Lysene多聚賴氨酸(北京中山生物制品公司)，P53檢測試劑盒(美國Santa Gruz Biotechnology公司)，原位未端標記細胞凋亡試劑盒(美國 Oncogene試劑公司)，Bcl-2檢測試劑盒(北京中山生物制品公司)。

1.2 動物模型的制備及分組雄性健康SD大鼠90只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，體質(zhì)量為(300±20) g。隨機分為3組(n=30)：假手術(shù)組(SO組)、缺血再灌注組(IR組)和Bcl-2過度表達組(Bcl-2組)。

Bcl-2組模型利用西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)院生物技術(shù)室hbcl-2 cDNA克隆載體，設(shè)計引物序列為： 5′-CTCGAGTATGGCGCAAGCCGGGAG,3′-GCGGCCGCTCACTTGTGGCCCAGG-TATGCACC，進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物純化后，與pLNCX2進行雙酶切，并用T4DNA連接酶定向連接，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLN-Bcl。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染法將該載體導(dǎo)入包裝細胞PT-67，篩選陽性細胞克隆，進一步培養(yǎng)，收集和濃縮病毒液，最后測定病毒滴度。……