Bcl-2過度表達對全腦缺血再灌注后大鼠海馬回P53蛋白表達的影響

李 偉，吳 剛，薛榮亮

(西安交通大學醫學院第二附屬醫院麻醉科，陜西 西安 710004)

在腦缺血再灌注損傷中，程序性細胞死亡即凋亡是腦缺血再灌注損傷神經元死亡的主要方式，對其機制的研究是目前的熱點。研究[1]表明：細胞凋亡受多種基因調控，Bcl-2與p53被認為是最重要的調控基因。p53可調節多種基因的轉錄，參與DNA復制與損傷修復，誘導凋亡。所以，p53及其相關基因的表達已成為目前腦缺血再灌注損傷神經元死亡的關鍵環節。Bcl-2是凋亡重要調控基因，目前認為，Bcl-2可抑制細胞凋亡，其家族基因在調節線粒體通透性中發揮重要作用。在腦缺血再灌注損傷中Bcl-2對p53表達有無影響尚未見相關研究報道。因此，本研究利用過度表達Bcl-2的大鼠，研究其腦缺血再灌注后P53蛋白的表達，探討Bcl-2的抗凋亡作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑4%多聚甲醛、磷酸鹽緩沖液(PBS)及Poly-Lysene多聚賴氨酸(北京中山生物制品公司)，P53檢測試劑盒(美國Santa Gruz Biotechnology公司)，原位未端標記細胞凋亡試劑盒(美國 Oncogene試劑公司)，Bcl-2檢測試劑盒(北京中山生物制品公司)。

1.2 動物模型的制備及分組雄性健康SD大鼠90只，由西安交通大學醫學院動物中心提供，體質量為(300±20) g。隨機分為3組(n=30)：假手術組(SO組)、缺血再灌注組(IR組)和Bcl-2過度表達組(Bcl-2組)。

Bcl-2組模型利用西北農林科技大學生命科學院生物技術室hbcl-2 cDNA克隆載體，設計引物序列為： 5′-CTCGAGTATGGCGCAAGCCGGGAG,3′-GCGGCCGCTCACTTGTGGCCCAGG-TATGCACC，進行PCR擴增。PCR產物純化后，與pLNCX2進行雙酶切，并用T4DNA連接酶定向連接，構建逆轉錄病毒載體pLN-Bcl。脂質體Lipofectamine 2000轉染法將該載體導入包裝細胞PT-67，篩選陽性細胞克隆，進一步培養，收集和濃縮病毒液，最后測定病毒滴度。SD大鼠麻醉固定，參照大鼠立體定位圖譜，在立體定位儀上用10 μL的Hamilton微量注射器向左右側的海馬回各注射病毒濃縮液5 μL[2]。

IR組及Bcl-2組全腦缺血再灌注動物模型采用4-血管法建立，全腦缺血6 min后再灌注。SO組大鼠只暴露血管而不夾閉，其余操作與另兩組相同。麻醉方法采用2%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1行腹腔內注射。分別于再灌注后6、12、24、48、72及96 h處死，用4%多聚甲醛200 mL灌注，切取腦組織標本，分別在4%多聚甲醛、酒精、二甲苯及石蠟中浸泡后，對標本行石蠟包埋。

1.3 P53免疫組織化學染色P53蛋白多克隆抗體及生物素標記羊抗原IgG抗體由Santa Cruz公司提供，對標本行免疫組織化學SP法染色，切片脫蠟后加P53多克隆抗體(兔IgG，滴度均為1∶50)染色。陽性標準為細胞核或者細胞漿染色呈棕黃色或淡黃色，測定灰度值。

1.4 細胞光鏡觀察術后6、12、24、48、72及96 h處死大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后HE染色，光鏡下觀察海馬組織學變化。

1.5 原位末端標記法參考李偉等[3]所用方法。石蠟切片經蛋白酶消化后，在末端脫氧核糖核酸轉移酶(TDT)作用下將生物素標記的核苷酸原位摻入DNA缺口，再與辣根過氧化酶標記的抗生物素蛋白抗體結合，顯色。

1.6 灰度值測定結果判斷P53陽性標準為切片中顯示細胞漿或細胞核有明顯的黃色、棕褐色顆粒或斑片狀。對P53陽性結果進行半定量測定，所用儀器為德國Leica-Q550E彩色圖文分析計算機系統。

2 結 果

2.1 腦缺血再灌注后P53蛋白在CA1及CA3區的表達及灰度變化全腦缺血再灌注24 h后，IR組CA1區P53蛋白開始微弱表達，隨后逐漸升高，于72 h達高峰，而后下降，主要位于胞核。CA3區于再灌注后48 h出現P53蛋白的表達，逐漸增加，于72 h達高峰后下降；但表達強度較CA1區弱，主要位于胞核。見表1。Bcl-2組P53蛋白CA1及CA3區表達強度弱于IR組，但其表達主要位于胞漿。見圖1(封二)。

表1 P53蛋白在海馬回CA1區和CA3區表達的變化

2.2 HE染色結果SO組中，海馬神經細胞排列有序，光鏡下細胞核透明清晰、可見1 ～ 2個明顯的核仁。全腦缺血再灌注6 h后，IR組HE染色改變不明顯；再灌注24 h后，CA1區神經細胞開始出現嚴重損傷性改變；再灌72 h后，神經細胞損傷最嚴重，光鏡下細胞數目降低，核膜不清晰，未見核仁。與CA1區比較，IR組CA3區神經細胞損傷較輕，Bcl-2組神經細胞損傷較IR組輕微。見圖2(封二)。

2.3 原位末端標記法結果IR組全腦缺血再灌注24～48 h后海馬CA1區凋亡細胞數最多；至再灌注72 h后，海馬CA1區凋亡細胞數開始減少，見表2。與CA1區比較，IR組CA3區24 ～ 96 h凋亡細胞數較少，見表2。與IR組比較，Bcl-2組凋亡細胞數少，見表2及圖3(封二)。

3 討 論

腦缺血再灌注后在神經細胞凋亡區域蛋白表達總體上顯著受到抑制，但卻有多種蛋白質和轉錄因子特異性和延遲性表達，P53即是其中較重要的一種。目前已證實，P53可介異細胞凋亡。Bcl-2家族是目前最受重視的凋亡相關基因家族。Bcl-2家族既能阻抑壞死又能阻抑凋亡[4]。Bcl-2過度表達對腦缺血再灌注損傷有保護作用，但其對P53的影響未見報道。

p53基因是與腦缺血再灌注后細胞凋亡關系較為密切的凋亡調控基因之一[5]。本研究利用4-血管法制作大鼠全腦缺血再灌注模型后發現：P53蛋白在缺血再灌注后24 h表達，72 h達到高峰，其表達時間與細胞凋亡時序相吻合，提示p53基因參與神經細胞凋亡的過程。海馬神經元對缺血十分敏感，常取海馬區測定P53蛋白[6]。本研究結果顯示：P53蛋白表達主要集中在CA1區，即神經元嚴重受損部位，CA3區雖有表達，但程度較CA1區弱，說明P53蛋白表達與凋亡分布在相同區域。本研究證實了P53參與全腦缺血再灌注后海馬神經元的凋亡。腦缺血再灌注可干擾腦的氧供和能量代謝，產生大量氧自由基，氧自由基可對DNA造成損傷。DNA受損時缺血缺氧等刺激可引起細胞內的蛋白激酶PKC和JNK磷酸化而激活p53，使p53在絲氨酸位點磷酸化。p53 mRNA和蛋白在細胞內積累，并且免疫活性增強，可直接引起凋亡，也可以通過調節其他相關基因引起凋亡，其作用機制可能是通過影響Bcl/Bax的平衡來調控凋亡。P53蛋白表達后，經過Bcl-2家族成員的調節，使Cyt-c從線粒體轉移至胞質，Cyt-c與凋亡蛋白激活因子(Apaf-l)和前caspase-9形成復合物，激活caspase-9，引起caspase家族級聯反應，最終導致凋亡。

表2 各組大鼠海馬回CA1 區和CA3區凋亡細胞數的變化

Bcl-2基因家族是一種重要的內源性抗凋亡因子，對維持腦缺血再灌注后某些神經細胞的生存有重要作用[7]。本研究通過向大鼠海馬內注入Bcl-2病毒載體，制成Bcl-2過度表達模型，結果發現：腦缺血再灌注后，CA1區神經元細胞凋亡明顯減少，說明Bcl-2的過度表達對神經細胞凋亡有抑制作用,與Linnk[8]的研究結果相符。Bcl-2主要位于線粒體,是一種可以對抗細胞凋亡發生的凋亡調控癌基因,主要分布在線粒體外膜、內質網和核周膜,可以調節膜的通透性,其拮抗細胞凋亡的作用與Bax促凋亡作用相對。Bcl-2可抑制內質網釋放Ca2+，抑制caspase-3的激活。研究[9]表明：線粒體膜通透性的增加與促凋亡的Bcl-2家族成員表達下調或抗凋亡的家族成員表達上調有關,Bcl-2水平的增高可抑制細胞凋亡。

本研究發現：Bcl-2組中P53的表達在CA1及CA3區都減弱，提示Bcl-2過度表達對P53的表達產生抑制。Bcl-2抗凋亡可能是通過抑制Bax等促凋亡基因的發揮。Bax是調控凋亡的Bcl-2家族的前凋亡成員,Bax已被確認為p53直接的早期應答基因。推測過度表達Bcl-2可抑制Bax的表達，從而抑制P53表達。本研究中還發現：P53的表達主要位于胞漿，胞核較少。Bcl-2可改變P53 CDC2及CDK2細胞周期調節和核-胞質運轉，Bcl-2與編碼p53基因的共表達延緩p53誘導的凋亡，Bcl-2封閉p53進入核中，從而阻斷P53誘導的調亡。這可能是在研究中Bcl-2組P53在海馬表達主要位于胞漿而胞核較少的原因之一。總之，缺血再灌注可導致P53的表達，誘導神經細胞凋亡而引發腦損害，Bcl-2過度表達可減弱P53的表達，但是否通過其抑制凋亡有待進一步研究。

[參考文獻]

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[3]李 偉,薛榮亮,張 瑛.腦缺血再灌注后神經細胞凋亡及c-Myc蛋白在海馬回的表達[J].陜西醫學雜志，2005,34(11)：1330-1333.

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