肝細胞中固有干擾素調節因子7的表達及其抗病毒作用

齊 月，金清龍，溫曉玉，牛俊奇

(吉林大學第一醫院肝膽胰內科，吉林 長春 130021)

在針對丙型肝炎病毒(HCV)的體外培養過程中，腫瘤細胞株HuH-7對于基因型2a型的HCV病毒株JFH1的復制容許度要遠遠高于人永生化細胞株HuS-E/2[1-2]。HuH-7和HuS-E/2基因表達的對比顯示：HuS-E/2細胞中存在干擾素調節因子7(interferon regulatory factor 7,IRF7)的固有表達，而HuH-7細胞中不具備這種基因的固有表達[3]。目前對于RNA病毒感染后，尤其是HCV感染后，細胞內部免疫反應的研究多使用HuH細胞株為研究工具，其研究結果表明：病毒感染后，通過激活IRF3，使其形成二聚體，進入細胞核內，誘導IFN 的轉錄，IFN 通過干擾素受體(IFNAR)，誘導IRF7的表達與激活，然后作用于細胞核內，誘導IFN 的轉錄表達，最終達到抑制病毒的作用[4-5]。而人原代肝細胞及永生化肝細胞中均可以檢測到IRF7的固有表達[3]，其作用尚不明確。考慮到固有表達 IRF7在細胞免疫反應中的作用[6]，本文作者擬通過檢測肝細胞中IRF7在病毒感染后相關免疫基因[7-12]誘導表達的作用，以及其對于HCV在HuH-7細胞中的感染復制的作用，評估HuH-7是否可以完全替代肝細胞作為HCV感染體外研究的工具。

1 材料與方法

1.1 細胞培養原代肝細胞凍存液(江陰齊氏)為商業制品，HuS-E/2細胞及HuH-7細胞由北海道大學Hussein Aly博士饋贈，HuS-E/2和原代肝細胞的培養條件為DMEM (Invitrogen)，內含44 mmol·L-1碳酸氫鈉、10 mmol·L-1煙堿、5%小牛血清 (Gibco)、5% AB型人血清(Sigma)、20 mmol·L-1HEPES (Gibco)、0.1 mmol·L-1長效抗壞血酸、5 mg·L-1EGF (Sigma)、100 mg·L-1鏈霉素、1%DMSO、8 mg·L-1脯氨酸、0.25 mg·L-1胰島素 (Sigma)、50 nmol·L-1地塞米松、100 IU·mL-1青霉素及2 mg·L-1兩性霉素B。37℃、CO2孵箱培養。HuH-7的培養條件為DMEM (Invitrogen)，內含100 IU·mL-1青霉素、10%小牛血清 (Gibco)、20 mmol·L-1HEPES (Gibco)及100 mg·L-1鏈霉素。

1.2 抗體及免疫熒光染抗-IRF7抗體(H246,Santa Cruz Biotechnology),Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG(A11008,Invitrogen)，Alexa Fluor 546 山羊抗人IgG(A11027，Invitrogen)均為商業制品。以纖維蛋白原Ⅰ包被的玻璃培養板培養HuH-7細胞，以含有JFH1的培養基孵育過夜進行感染，以HCV感染者血清作為第一抗體標記HCV感染的細胞。以纖維蛋白原Ⅰ包被的玻璃培養板培養原代肝細胞，以仙臺病毒(Sendai virus,SV)感染，在指定時間點，以抗IRF7抗體作為第一抗體進行標記。采用熒光顯微鏡Biozero進行檢測。

1.3 質粒構建及轉染以293T細胞的全長RNA作為模板，利用逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)技術，克隆全長IRF7的cDNA,并插入pcDNA3表達載體中，構建pcDNA3-IRF7表達質粒。FuGENE transfection reagent(Promega)作為HuH-7細胞的轉染試劑，Effectene transfection reagent (Qiagen) 作為原代肝細胞的轉染試劑，按照試劑盒提供的說明書進行轉染。IRF7顯性負性突變體表達質粒pcDNA3-7DN為北海道大學Hussein Aly博士饋贈[3]。psiRNA-hIRF-7(Invitrogen)為商業制品。

1.4 RNA的提取采用RT-PCR及實時定量PCR(real time PCR)，以氯仿乙醇法提取細胞全長RNA[2]，以200 ng全長RNA為模板，以one step RNA PCR kit (Takara)進行RT-PCR，通過對比特定長度的cDNA條帶灰度，比較其mRNA的表達水平，以40 ng全長RNA 為模板，以SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems)進行實時定量PCR，通過比較mRNA的相對量來比較基因表達情況。GAPDH 上游引物：5′- CCATGGAGAAGGCTGGGG-3′，下游引物：5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′；IFNα1上游引物：5′-TGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCA-3′，下游引物：5′-TCTGCTCTGACAACCTCAGGCAC-3′；IFNβ上游引物：5′-TTCAGAGGACAGTCGCCACC-3′，下游引物：5′-ATGCCCCAGACCTCCTTCTC-3′；IFNλ3上游引物：5′-GCACACACGAGGCCTATGTC-3′，下游引物：5′-CTTCCACCTGGCCAGGAATC-3′；RIG-I上游引物：5′-GCTCCTACAGGTTGTGGAAA-3′，下游引物：5′-CAGTGGGCCTGAAGATCCTC-3′；IRF7上游引物：5′- TGCTGCCTCGGAACTGTGAC-3′，下游引物：5′- TCACCAGGACCAGGCTCTTC -3′。

2 結 果

2.1 HuH-7細胞與肝細胞在RNA病毒感染后的免疫相關基因表達RT-PCR檢測結果顯示：未經感染的HuH-7中無IRF7的表達，而原代肝細胞中存在IRF7的固有表達(圖1)。在感染12 h之內，相同RT-PCR檢測條件下，HuH-7細胞中未檢測到相關基因RNA的條帶，而原代肝細胞中檢測到IFNα1、IFNβ、IFNλ3和RIG-I 的誘導表達。但IFNα1的誘導表達量很低(圖2)。

圖1 IRF7在未經感染的原代肝細胞和HuH-7細胞中的表達

2.2 永生化肝細胞在RNA病毒感染后的干擾素誘導在感染早期，表達7DN的細胞中，IFNα1、RIG-I、IFNβ和IFNλ3的誘導均受到抑制，但感染6 h后，這種抑制逐漸消退(圖3)。轉染psiRNA-hIRF-7 HuS-E/2細胞中IRF-7的mRNA水平降低至正常水平的20%。實時PCR法檢測，SV感染3 h內IFNα1、RIG-I、IFNβ和IFNλ3的表達情況見圖4，結果顯示：在永生化肝細胞被SV感染的前3 h，可以檢測到上述基因的誘導表達，而在IRF-7 mRNA下調的細胞中，上述基因的表達水平明顯降低。

圖2 SV感染后相關基因的表達

圖3 HuS-E/2細胞中IFNα1、IFNβ、IFNλ3和 RIG-I的表達

2.3 感染前即存在IRF7異位表達的HuH-7細胞中JFH1的感染水平與轉染pcDNA3的細胞比較表達異位IRF7的HuH-7細胞中，JFH1的感染率明顯下降(圖5，見封二)。提示IRF7的異位表達可以抑制HuH-7細胞中HCV的感染復制。利用健康者血清作為第一抗體重復檢測轉染空載體的HuH-7細胞時，IRF7及HCV感染的信號見圖6(封二)。

3 討 論

IRF7參與免疫過程中細胞干擾素的誘導，機體的大部分細胞不存在IRF7的固有表達，在HCV感染后，通過IFNβ誘導，可以大量產生。但最近有研究報道：人肝細胞中存在大量固有表達的IRF7，其功能尚不清楚。本研究通過轉染IRF7表達載體入沒有IRF7固有表達的HuH-7細胞，檢測其轉染前后HCV的感染支持水平，對比HuH-7細胞與肝細胞在SV感染后IFNα1、RIG-I,、IFNβ和IFNλ3的誘導以及抑制IRF7功能，以上述基因的表達變化來初步闡述IRF7在肝細胞病毒感染后免疫反應中的作用。肝臟是人體最大的實體免疫器官，其生理地位決定了其要面對大量的入侵因素，包括病毒、細菌等，IRF7的固有表達，很可能決定了肝臟應對各種入侵因素的反應程度，有利于機體的免疫應答。本研究結果從另外一個角度說明目前比較常用的HuH-7細胞并不能完全真實地反應HCV感染肝細胞的情況，尚需開發新HCV體外模型，以便更好地進行HCV感染的研究。

圖4 實時PCR檢測SV感染3 h內HuS-E/2細胞中RIG-I (A)、IFNα1(B)、IFNλ3(C)和IFNβ(D)的表達

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