Smad2/3/4真核表達質粒的構建及重組蛋白表達

張紅艷，王春玉，姚 遠，李彥姝，王 迪，李 豐

(1.中國醫科大學細胞生物學教研室 衛生部細胞生物學重點實驗室 教育部醫學細胞生物學重點實驗室 遼寧 沈陽 110001;2.遼寧省人民醫院消化內科，遼寧 沈陽 110016)

轉化生長因子β(TGF-β)超家族是一類作用繁多的細胞因子，參與細胞增殖、分化、細胞外基質改建及胚胎發育等多種細胞活動，并在多種疾病尤其是腫瘤、纖維變性類疾病及自身免疫性疾病的發病中扮演著重要角色[1-2]。TGF-β超家族包括TGF-β、骨形態發生蛋白(BMP)和活化素(activins)等亞類，可以通過激活多個下游信號通路行使其功能，其中Smads信號通路被認為是最關鍵的。Smads蛋白家族包括8個成員，分為R-Smads，Co-Smad和I-Smads 3類[3]。R-Smads包括Smad1/2/3/5/8，能夠與受體結合并被受體磷酸化而激活；Co-Smad指Smad4，能夠與活化了的R-Smads結合形成復合體，該復合體可進核結合DNA并與多種轉錄輔因子共同作用調控基因轉錄；I-Smads包括Smad6/7，作為R-Smads的競爭性抑制子，負向調控TGF-β通路。TGF-β信號通路受精密的調控，不同的上游配體激活不同的下游分子。TGF-β1屬于TGF-β超家族的TGF-β亞類，Smad2/3/4參與該信號通路。Smad2/3/4在細胞質中與多種蛋白相互作用，如SARA[4]和PDK1[5]等。作為TGF-β1通路的重要下游蛋白，Smad2/3/4與某些相互作用蛋白的結合受TGF-β1調控。在TGF-β1作用下，PDK1與Smad2/3/4的結合減弱[5]；而Smad2與SARA的結合依賴于TGF-β1刺激[4]。本研究旨在利用基因重組技術構建pcDNA3.1myc-HisA Smad2/3/4真核表達質粒，使用標簽抗體建檢測Smad2/3/4在細胞中的表達，同時使用標簽抗體進行免疫沉淀，質譜分析Smad2/3/4新的相互作用蛋白，進一步探索其生物學功能及在TGF-β信號通路中的功能。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞和質粒大腸桿菌DH5α感受態為本實驗室制備；……