Smad2/3/4真核表達質粒的構建及重組蛋白表達

張紅艷，王春玉，姚 遠，李彥姝，王 迪，李 豐

(1.中國醫科大學細胞生物學教研室 衛生部細胞生物學重點實驗室 教育部醫學細胞生物學重點實驗室 遼寧 沈陽 110001;2.遼寧省人民醫院消化內科，遼寧 沈陽 110016)

轉化生長因子β(TGF-β)超家族是一類作用繁多的細胞因子，參與細胞增殖、分化、細胞外基質改建及胚胎發育等多種細胞活動，并在多種疾病尤其是腫瘤、纖維變性類疾病及自身免疫性疾病的發病中扮演著重要角色[1-2]。TGF-β超家族包括TGF-β、骨形態發生蛋白(BMP)和活化素(activins)等亞類，可以通過激活多個下游信號通路行使其功能，其中Smads信號通路被認為是最關鍵的。Smads蛋白家族包括8個成員，分為R-Smads，Co-Smad和I-Smads 3類[3]。R-Smads包括Smad1/2/3/5/8，能夠與受體結合并被受體磷酸化而激活；Co-Smad指Smad4，能夠與活化了的R-Smads結合形成復合體，該復合體可進核結合DNA并與多種轉錄輔因子共同作用調控基因轉錄；I-Smads包括Smad6/7，作為R-Smads的競爭性抑制子，負向調控TGF-β通路。TGF-β信號通路受精密的調控，不同的上游配體激活不同的下游分子。TGF-β1屬于TGF-β超家族的TGF-β亞類，Smad2/3/4參與該信號通路。Smad2/3/4在細胞質中與多種蛋白相互作用，如SARA[4]和PDK1[5]等。作為TGF-β1通路的重要下游蛋白，Smad2/3/4與某些相互作用蛋白的結合受TGF-β1調控。在TGF-β1作用下，PDK1與Smad2/3/4的結合減弱[5]；而Smad2與SARA的結合依賴于TGF-β1刺激[4]。本研究旨在利用基因重組技術構建pcDNA3.1myc-HisA Smad2/3/4真核表達質粒，使用標簽抗體建檢測Smad2/3/4在細胞中的表達，同時使用標簽抗體進行免疫沉淀，質譜分析Smad2/3/4新的相互作用蛋白，進一步探索其生物學功能及在TGF-β信號通路中的功能。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞和質粒大腸桿菌DH5α感受態為本實驗室制備；HEK293細胞為本實驗室保存；pcDNA3.1myc-HisA載體購自Invitrogen公司，pcDNA3.1-Smad2/3受贈于Sabelle van Seuningen教授，pGEX2T-Smad4受贈于Koichi Shimada教授。

1.2 試 劑PyrobestTMDNA polymerase、dNTP、限制性核酸內切酶EcoRⅠ和KpnⅠ均購自大連 TaKaRa公司；質粒提取及DNA電泳凝膠回收試劑盒購自Promega公司；DNA 和蛋白 marker購自GenScript公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；Myc抗體購自Santa公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋公司；引物合成和DNA測序測定由Invitrogen公司完成；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；DMEM及胎牛血清購自Gibco公司；ECL發光試劑盒購自GE Healthcare 公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 Smad2/3/4全長基因擴增設計Smad2/3/4擴增的PCR引物，并在引物中加入EcoRⅠ和KpnⅠ2個限制性酶切位點。引物序列見表1。以質粒為模板，利用pyrobest酶，通過PCR擴增，獲得Smad2/3/4全長編碼序列。

表1 引物序列及酶切位點

1.4 pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4表達載體的構建將pcDNA3.1myc-HisA載體和Smad2/3/4 PCR片段用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠回收純化產物。回收產物摩爾比按照1∶5(載體∶片段 )比例，利用T4 DNA連接酶，將2個片段常溫連接2 h，然后16℃連接過夜，取5 μL連接產物轉化到DH5α大腸桿菌感受態細胞中，涂于LB/Amp平板，37℃培養過夜。挑取菌落，接種于含氨芐西林的LB培養基中，37℃振蕩過夜。一部分菌液用來保存菌種，另一部分用堿裂解法提取質粒DNA，用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定外源基因的插入，質粒DNA送Invitrogen公司進行測序分析。

1.5 pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4瞬時轉染HEK293細胞系HEK293細胞用10%胎牛血清的高糖DMEM高糖培養基培養，細胞鋪于6孔板至70% ～ 80%融合，按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine 2000轉染6孔板的說明書進行操作。

1.6 蛋白質提取與Western blotting鑒定轉染24 h后，棄掉培養基，用PBS清洗2次。在細胞中加入60 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用橡皮刮刀將細胞緩慢刮下。收集所有液體至新的離心管中，冰上放置10 min，裂解細胞。13 000 g、4℃離心30 min，將上清轉到新的離心管中，取上清5 μL，利用考馬斯亮藍G250染液和0.5 g·L-1BSA，繪制標準曲線，測量595 nm的吸光度(A)值，以結果做直線回歸方程:Y = aX + b。測量蛋白樣品與對照在595 nm的A值，差值代入標準曲線方程，求出相應蛋白濃度。

將蛋白定量后，取80 μg總蛋白經10% SDS-PAGE凝膠分離，4℃過夜，40 V恒壓轉移到PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h。用Flag抗體(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠(1∶5 000稀釋)二抗孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯影，Western blotting成像系統采集圖像。

2 結 果

2.1 PCR擴增Smad2/3/4基因全長以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4質粒為模板，特異性引物進行PCR擴增Smad2/3/4基因全長。擴增條件為95℃、5 min預變性；95℃、1 min，55℃、1 min，72℃、1 min，進行30個循環；72℃、10 min，溫度降至4℃。1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色后，在紫外燈下觀察結果。見圖1。

2.2 重組質粒pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4的構建及鑒定每個質粒挑取2個克隆，將重組質粒pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后，圖2中1和2泳道為Smad2，得到5 400和1 401 bp 的2條帶；3和4泳道為Smad3，得到5 400和1 275 bp的2條帶；5和6泳道為Smad4，5泳道得到5 400和1 656 bp的2條帶，6泳道未得到目的片段。重組質粒的酶切鑒定表明質粒構建成功，經過測序分析，外源系列在NCBI-Blast比對結果與Smad2/3/4編碼序列一致。

圖1 Smad2/3/4基因PCR產物的擴增

圖2 重組質粒pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4酶切分析

2.3 Western blotting檢測蛋白表達分別將pcDNA3.1myc-HisA空載和pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4轉染HEK293細胞，24 h后收集細胞，提取蛋白，經SDS-PAGE凝膠電泳，Western blotting檢測蛋白表達，轉染pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4，有一明顯條帶(圖3)，空載體對照組未出現反應條帶，結果表明構建的真核表達質粒在HEK293細胞中表達。

3 討 論

TGF-β對上皮細胞生長有抑制作用。在腫瘤早期，可以抑制腫瘤的發生。但是，在腫瘤晚期，TGF-β1的生長抑制作用被限制，并通過引起細胞的上皮向間質轉化促進癌細胞遷移和侵襲[6]。一些腫瘤中存在TGF-β信號通路蛋白(如TβRⅡ，Smad4)的突變，從而逃避TGF-β引起的生長抑制。利用細胞系進行研究發現：僅40%的胃癌細胞中存在TGF-β信號通路蛋白的突變，但在外源轉入突變蛋白對應的野生型蛋白后，其中75%的細胞仍然不能恢復對TGF-β的反應性，這提示胃癌細胞內存在重要的TGF-β通路抑制因子。有學者[7-8]發現一些TGF-β通路的抑制因子，如在骨髓瘤中CDK2通過磷酸化Smad2的MH1區破壞TGF-β引起的轉錄調節功能；Cam kinaseⅡ通過磷酸化Smad2/3/4抑制TGF-β/Smads的轉錄調節功能；PKB通過結合Smad3抑制其轉錄活性及核轉位。但是，還可能存在未被發現的TGF-β通路抑制因子。

圖3 Western blotting檢測pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4 融合蛋白在HEK293細胞中的表達

經典的Smads信號通路是TGF-β作為配體與相應膜受體結合，進而激活相應下游信號蛋白Smads，行使對應的生物學功能，形成一個嚴格而精密的信號網絡。TGF-β1屬于TGF 超家族的TGF 亞類，能夠結合并激活細胞膜上的TGF-β受體Ⅱ(TβRⅡ)，活化的TβRⅡ進而結合并磷酸化同樣位于細胞膜上的TGF-β受體Ⅰ(TβRⅠ，AKL5)。具有活性的受體復合體形成后，細胞質內的Smad2/3 C末端的SSXS序列被TβRⅠ磷酸化，與Smad4形成復合體，進入細胞核并行使基因轉錄調控功能[9]。

最近有研究表明：雖然經典的Smads作用是由R-Smads與Smad4形成復合體來完成，但也存在不依賴Smad4的情況。在角質細胞中，IKKalpha能夠結合Smad2/3并促進Mad1、Mad2等介導TGF-β引起的細胞生長抑制基因的表達，這種促進不依賴于Smad4[10]。在造血干細胞中，核蛋白轉錄中介因子1γ(TIF1γ)能夠與Smad4競爭和Smad2/3的結合，介導TGF-β/Smads引起的不同作用：Smad2/3-TIF1γ介導細胞分化，而Smad2/3-Smad4介導細胞的生長抑制[11]。

目前，腫瘤已經成為威脅人類健康的重要疾病，其發病率逐年上升，但其發生發展的分子機制仍未完全闡明，TGF-β/ Smads 信號轉導通路在機體組織中生物學作用廣泛,與腫瘤的發生發展密切相關。因此，本實驗利用DNA重組技術將Smad2/3/4重組到pcDNA3.1myc-HisA載體中，通過酶切和測序保證擴增片段的正確性，并采用Western blotting方法證實融合蛋白的表達。融合蛋白中含有myc標簽，可用于目標蛋白的純化和檢測。

綜上所述，本實驗成功構建pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4真核表達質粒，為進一步研究其在信號轉導通路中的作用提供了實驗基礎。

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