CM-Dil體外標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其在燒傷大鼠模型腸組織內(nèi)的示蹤

尹 飛，郭 麗，孟春陽，周煜博，張 晗，王冬耀，楊小玉

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院脊柱外科，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科，吉林 長春 130033)

嚴(yán)重?zé)齻恢笔抢_醫(yī)學(xué)界的難題，目前由于治療措施的改善，直接因為休克或感染死亡的人數(shù)日益減少，主要死因是臟器功能衰竭。腸道是嚴(yán)重?zé)齻笞钤绨l(fā)生低灌注的器官，也是對缺血、缺氧最為敏感的器官之一，是最先受累和損傷較重的內(nèi)臟器官[1]。目前嚴(yán)重?zé)齻詫ΠY支持治療等為主，但是效果不理想，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的發(fā)現(xiàn)為其治療帶來了新希望。MSCs是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于人類、鳥類、嚙齒類等動物的骨髓中，具有進入體內(nèi)后可定位于受損部位并修復(fù)其損傷的作用[2-3]。但是采取何種有效的標(biāo)記方法追蹤移植細(xì)胞在體內(nèi)的分布和定植成為探討MSCs修復(fù)嚴(yán)重?zé)齻麢C制的前提。目前標(biāo)記移植干細(xì)胞的方法主要有兩種：一種是傳統(tǒng)的標(biāo)記方法，另一種是分子影像學(xué)技術(shù)。傳統(tǒng)的標(biāo)記物主要有胞漿標(biāo)記物、核酸標(biāo)記物和改變細(xì)胞基因使其表達(dá)特異性的標(biāo)志物3種。影像學(xué)技術(shù)目前主要有光學(xué)成像、核醫(yī)學(xué)分子顯像活體示蹤和磁共振細(xì)胞成像活體示蹤3種技術(shù)[4]。氯甲基苯甲酰胺(chloromethyl-benzamidodialkyl-carbocyanine,CM-Dil)是一種親脂性熒光染料，容易嵌入生物質(zhì)膜內(nèi)并在膜內(nèi)做側(cè)向擴散運動而標(biāo)記整個細(xì)胞，在標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)消失慢[5]。本文作者擬探討CM-Dil體外標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)的情況及標(biāo)記后干細(xì)胞在嚴(yán)重?zé)齻Ｐ痛笫竽c組織內(nèi)的定植情況，為BMSCs進一步修復(fù)嚴(yán)重?zé)齻笫蟮哪c損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試 劑DMEM-F12(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國HyClone公司)；維甲酸(retinoic acid,RA，美國Sigma公司);堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth facto，EGF)均為美國PeproTech公司產(chǎn)品；神經(jīng)元特異核蛋白(NeuN)、S-P試劑盒和DAB顯色劑(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；兔抗神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；CM-Dil(美國Invitrogen公司)；Hoechst33342(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(上海炎衫化工科技有限公司)。

1.2 實驗動物健康雄性成年Wistar大鼠，體質(zhì)量(220±20) g，1周齡Wistar大鼠均購于吉林大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK-(吉)2008-0005。

1.3 BMSCs的分離和培養(yǎng)1周齡Wistar大鼠脫頸處死后無菌取出股骨和脛骨，用DMEM-F12培養(yǎng)基沖出骨髓于培養(yǎng)皿內(nèi)，過4號針頭，制成單細(xì)胞，以1×106mL-1的細(xì)胞密度接種于75 mL培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)。72 h后首次換液，7 d傳代。細(xì)胞70%～80%融合后0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2～3 d傳代1次。

1.4 誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞取第4代細(xì)胞，以每孔1×105個細(xì)胞密度接種于鋪有涂多聚賴氨酸的蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，加入無血清DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。2 d后加入含10 μg·L-1bFGF、10 μg·L-1EGF和15%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后加入含1 μmol·L-1的RA培養(yǎng)。3 d后取出蓋玻片，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測神經(jīng)元表面標(biāo)志NeuN和MAP-2 的表達(dá)。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測神經(jīng)元表面標(biāo)志NeuN和MAP-2 的表達(dá)1% TritonX-100 PBS溶液孵育20 min,內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑室溫孵育10 min，動物非免疫血清封閉10 min，第一抗體4℃孵育過夜，生物素標(biāo)記的第二抗體孵育，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶孵育30 min，DAB顯色數(shù)秒，蘇木精復(fù)染，脫水、透明，樹脂封片。

1.6 CCK-8法檢測CM-Dil對BMSCs的細(xì)胞毒性作用取生長良好的第4代細(xì)胞，以每孔細(xì)胞密度5×103個接種于96孔培養(yǎng)板，每組4個復(fù)孔，每孔加入完全培養(yǎng)基200 μL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為4、6和8 mg·L-1的CM-Dil冰浴15 min，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育4 h。酶標(biāo)儀測定450 nm各孔的吸光度(A)值。同時設(shè)置空白孔(加培養(yǎng)基和CCK-8溶液，無細(xì)胞)和對照孔(不含CM-Dil培養(yǎng)基和CCK-8溶液，有細(xì)胞)。細(xì)胞活力(%)=(加藥細(xì)胞A值-空白A值)/(對照細(xì)胞A值-空白A值)×100%。

1.7 檢測CM-Dil標(biāo)記BMSCs的標(biāo)記率取生長良好的第4代細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，加入終濃度為4 mg·L-1CM-Dil冰浴15 min，流式細(xì)胞儀分析標(biāo)記率。

1.8 燒傷大鼠模型建立Wistar大鼠用8%的硫化鈉進行全身30%脫毛處理，脫毛處理24 h后，用10%水合氯醛進行麻醉(3 mL·kg-1)，麻醉后，將大鼠脫毛部分浸入(97±1)℃水中18 s。

1.9 BMSCs的移植收取細(xì)胞，過4號針頭，制成單細(xì)胞，離心去上清。以4 mg·L-1CM-Dil溶液標(biāo)記細(xì)胞，PBS洗3次。分別于燒傷后30 min和24 h后經(jīng)球后靜脈移植BMSCs，每次移植5×106個細(xì)胞，體積0.1 mL。模型組給予同等劑量的PBS溶液。

1.10 腸組織冰凍切片制備及激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞移植燒傷大鼠2周和6個月后，取大鼠腸組織，中性甲醛溶液固定1 d，25%～30%蔗糖溶液沉淀1 d。將沉淀好的腸組織進行冰凍切片，5 mg·L-1Hoechst 33342染色，激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BMSCs的體外培養(yǎng)原代培養(yǎng)中，細(xì)胞種植后3 h貼壁。3 d 首次換液后，貼壁細(xì)胞增多，形態(tài)為梭形和三角形。7 d左右胰酶消化傳代，傳代后的細(xì)胞生長速度較快，每3～4 d可傳代1次。

2.2 誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞BMSCs加入含bFGF、EGF和 RA培養(yǎng)后，部分細(xì)胞出現(xiàn)長的突觸，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：誘導(dǎo)組有NeuN和MAP-2 陽性細(xì)胞表達(dá)，對照組未見陽性表達(dá)細(xì)胞，表明骨髓MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，見圖1(插頁一)。

2.3 CCK-8法檢測CM-Dil對BMSCs的細(xì)胞毒性作用8 mg·L-1CM-Dil組細(xì)胞毒性顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組比較，4和6 mg·L-1組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但是6 mg·L-1組細(xì)胞活力下降，因此4 mg·L-1被確定為移植細(xì)胞的標(biāo)記濃度。見表1。倒置顯微鏡下觀察，4 mg·L-1CM-Dil標(biāo)記后細(xì)胞形態(tài)無變化。

表1 CCK-8法檢測CM-Dil 標(biāo)記后BMSCs細(xì)胞活力的變化

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞標(biāo)記率4 mg·L-1CM-Dil標(biāo)記BMSCs后，流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記率為93.9%。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測4 mg·L-1 CM-Dil對BMSCs的標(biāo)記率

2.5 熒光顯微鏡觀察CM-Dil標(biāo)記的BMSCsCM-Dil標(biāo)記細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可見BMSCs細(xì)胞胞漿發(fā)出紅色熒光。見圖3(插頁一)。

2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察BMSCs在腸組織內(nèi)的分布激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞移植后2周可見標(biāo)記的干細(xì)胞定位在受損傷的腸組織區(qū)中，出現(xiàn)紅色熒光標(biāo)記細(xì)胞，并可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)，表明被CM-Dil標(biāo)記的BMSCs已定植到受損傷的腸組織內(nèi)；細(xì)胞移植后6個月，在小腸組織中仍可觀察定植的干細(xì)胞。見圖4(插頁二)。

3 討 論

本實驗結(jié)果顯示：8 mg·L-1組細(xì)胞毒性顯著高于對照組，4和6 mg·L-1組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，6 mg·L-1組細(xì)胞活力下降(86.41%)，因此選用4 mg·L-1進行標(biāo)記；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：標(biāo)記率為93.9%，提示絕大多數(shù)BMSCs已被標(biāo)記，能夠達(dá)到其在體內(nèi)示蹤的要求；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：移植后2周出現(xiàn)紅色熒光標(biāo)記細(xì)胞，并可見到細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可見標(biāo)記的干細(xì)胞定位在受損傷的腸組織區(qū)中，表明被CM-Dil標(biāo)記的BMSCs已定植到受損傷的腸組織內(nèi)，細(xì)胞移植后6個月，在小腸組織中仍可觀察到定位的干細(xì)胞。

關(guān)于干細(xì)胞移植示蹤的方法有多種。親脂性碳花青熒光膜染料CM-Dil是目前最好的熒光示蹤染料，能夠與含肽和蛋白質(zhì)的硫氫基相結(jié)合，可通過活體細(xì)胞的胞飲作用進入胞質(zhì),從而標(biāo)記整個細(xì)胞質(zhì)[6-8]，其熒光激發(fā)波長為553 nm，激發(fā)后可發(fā)出波長570 nm紅色熒光。已有研究[9]表明：CM-Dil標(biāo)記的BMSCs能夠在體內(nèi)示蹤長達(dá)30 d，而且經(jīng)過固定和石蠟包埋過程后仍然可檢測到，是一種使用方便、標(biāo)記穩(wěn)定的熒光膜染料。Zong 等[10]將CM-Dil 標(biāo)記的人MSCs 的乳酸-羥基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA)支架移植到大鼠顱骨缺損部位，10周后熒光顯微鏡下仍可檢測到標(biāo)記細(xì)胞。本研究結(jié)果表明：CM-Dil標(biāo)記的細(xì)胞可再體內(nèi)示蹤達(dá)6個月。

MSCs主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，如骨髓、骨骼肌、臍血、胎盤及脂肪組織等，具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下可分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞。本實驗所培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。BMSCs還具有“歸巢”的特點，在進入體內(nèi)后受到許多趨化因子的調(diào)控，可定位于受損傷的部位并修復(fù)損傷。近幾年，大量實驗證實了BMSCs能夠定位于受損的心肌組織并能修復(fù)損傷，修復(fù)心臟損傷的機制包括分化成新的心肌細(xì)胞取代壞死的心肌細(xì)胞以及對心臟梗死區(qū)域內(nèi)血管再通起作用等[11-14]。此外，在肝臟、腎臟等疾病研究中，移植后的BMSCs也可定植于相應(yīng)組織器官內(nèi)[15-16]。Sémont等[17]將人BMSCs移植進放射性胃腸道損傷的NOD/SCID小鼠中，能促進小鼠小腸結(jié)構(gòu)和功能的快速恢復(fù)，延長了小鼠的壽命，這種作用是由于MSCs促進了小腸上皮的更新；通過免疫組織化學(xué)檢測Ki67和TUNEL染色檢測凋亡，表明MSCs是通過促進放射性損傷的小腸上皮細(xì)胞的增殖和抑制凋亡來重建細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而有利于小腸組織的重建。

本研究中CM-Dil標(biāo)記的BMSCs通過球后靜脈移植后，能夠長期定位于受損的大鼠腸組織內(nèi)，表明CM-Dil標(biāo)記的BMSCs可以用于燒傷大鼠的腸組織定植的示蹤研究。

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